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免疫染色の対比染色 トピック削除
No.21-TOPIC - 2009/02/12 (木) 16:02:38 - eri
免疫組織の対比染色で，ヘマトキシリンを使用していますが，どうも対比染色にしては濃く出過ぎているような気がします．
Mayerのヘマトキシリン溶液はMERCK（HX749548）のものを使い，5秒間浸けています．
このMERCKのヘマトキシリンは，濃いから希釈して使わないといけないと聞いたことがありますが，何倍ほどに希釈したらよいのかがわかりません．
現在は，2倍希釈で使っています．
どなたか，希釈倍率についてご存知の方がいらっしゃいましたら，教えていただけるとありがたいです．
よろしくお願いします．
　
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No.21-8 - 2009/02/17 (火) 10:43:12 - CJ
対比染色は写真のコントラストがよくなるような色の選択をすると後々便利です。
脳みその場合、
DABで染めた場合：Cresyl Violetで薄めに染める
Ni-DABで染めた場合：Neutral Red(pHを7.4位にしておくこと！）でよく染める。
両者の色素とも、エタノール中での放置時間を調節することで染まり具合を調節できます。（クレシル紫の場合酢酸エタノールが便利）。
脳みそ以外の組織だとメチルグリーンはDABとよいコントラストを示していいと思います。

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No.21-7 - 2009/02/15 (日) 11:17:58 - 一般人
HE染色の色出しは、当研究室では流水１０分→飽和炭酸リチウム １分→流水５分でやっています。

飽和炭酸リチウムを挟まなくても良いですが、やや良い染色像が得られるように感じます。


対比染色ではMethyl GreenやNuclear Fast Redなども染まりが良いと聞きます。私の先輩は希釈したエオジンを使ってました。

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No.21-6 - 2009/02/14 (土) 13:18:27 - eri
みなさま，お返事ありがとうございます．
水洗での色だしは，10分間行っています．
とりあえず，自分の目で見ながら調節していくのがいいようですので，数倍に薄めたものをいくつか試してみて，いい濃度のものを見つけてみようかと思っています．
アドバイスありがとうございました．

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No.21-5 - 2009/02/13 (金) 20:03:13 - AP
染色は、染色液の濃度と染色時間の兼ね合いですから、濃度を下げるのと、時間を短くするのは、同等と考えて良いと思います。ただし、一般的には同じ程度の染め具合なら薄い濃度で時間を延ばした方が鮮明だといわれています。それを意図して5倍から10倍くらいに薄めて使うこともあります。時間をかけて染色できるので、染まり具合を見ながら適当なところで止めることも出来ますし。
抗体染色の染色方法との兼ね合いもあるでしょうが、ヘマトキシリンで染めすぎた時は、薄い塩酸（0.1%程度）で洗って色をぬく方法もありましたね。

免疫染色のカウンターステインでは、メチレングリーン、メチレンブルー、ニュートラルレッドを使っているのをよく見ます。染まりが軽いです。

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No.21-4 - 2009/02/13 (金) 19:19:10 - 組織
ヘマトキシリン後の水洗は色出しといって、色調をクリアな青紫色に変えるためのステップです。ですので、たとえ水洗時間を長くしても染色が弱くなる訳ではありません。

メルクの染色液は染色時間を短縮させるために、ヘマトキシリンの濃度を上げてるものがあるみたいですね。HE染色だといいんでしょうが、対比染色には濃すぎるかもしれませんね。私は自作しか使ったことないので、どのくらい希釈すればいいかはわかりませんが、とりあえず4倍、8倍くらいまでは希釈しても問題ないと思います。このくらい薄めておけば、あとは染色時間で調節できるでしょう。

ちなみに私のラボでは、HE染色の使い古しのヘマトキシリン液を対比染色に使ってます。少々へたっている方が、染色時間を長くとれるので調節しやすいです。

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No.21-3 - 2009/02/13 (金) 15:26:23 - 匿名希望☆
私は、ヘマトキシリンは希釈せずに使っています。

3秒ほど浸けた後、水洗15〜30分。
しっかり水洗すれば、大丈夫なんじゃないかと。

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No.21-2 - 2009/02/13 (金) 13:48:08 - あ
流水での水洗（水だし）はなさっていますか？
私は10分以上行っています。
ヘマトキシリンは、希釈しなくても大丈夫です。

免疫染色の対比染色 削除/引用
No.21-1 - 2009/02/12 (木) 16:02:38 - eri
免疫組織の対比染色で，ヘマトキシリンを使用していますが，どうも対比染色にしては濃く出過ぎているような気がします．
Mayerのヘマトキシリン溶液はMERCK（HX749548）のものを使い，5秒間浸けています．
このMERCKのヘマトキシリンは，濃いから希釈して使わないといけないと聞いたことがありますが，何倍ほどに希釈したらよいのかがわかりません．
現在は，2倍希釈で使っています．
どなたか，希釈倍率についてご存知の方がいらっしゃいましたら，教えていただけるとありがたいです．
よろしくお願いします．
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