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CJ様ありがとうございました。 削除/引用 No.2089-5 - 2010/02/16 (火) 09:25:35 - toto ご回答ありがとうございました！ 大変参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.2089-4 - 2010/02/15 (月) 15:12:24 - CJ 私は切片しかやらないのでＴＳＡ法がホールマウントに使えるかどうかについてはコメントできません。浸透性が問題になるかもしれません。 ＴＳＡ−ＤＮＰの方法についてはお書きになっている手順で正しいです。

CJ様ありがとうございました。 削除/引用 No.2089-3 - 2010/02/15 (月) 13:34:09 - toto CJ様 さっそくの貴重な情報をありがとうございました。TSAという増幅法があることを初めて知りました（勉強不足で。。。）。 CJさんのTSAシステムを調べてみました。弱いシグナルでも検出できるシステムなんですね。 ネットで調べた限りでは組織切片で使われていたようですが、whole mount ISHでも使えるのでしょうか。 またこのシステムはいろいろな酵素や基質やハプテン（DNPやBiotinのことだと理解しましたが正しいでしょうか？）を組み合わせることができるようですね。 実験手順が調べてもよくわからないのですが、CJさんのやり方ですと、二次染色の方を、Digラベルプローブでハイブリダイズ後、HRPラベルanti-Dig抗体反応、さらにDNP plus TSAで反応後、HRPラベルanti-DNP抗体で反応させ、DABを基質に発色という手順でよいでしょうか？ またNBT-BCIPの青色発色はアルコールで溶けないのですね！対処法も教えていただき助かりました！まずはこの対処法で再度挑戦してみつつ、TSAシステムについても検討してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2089-2 - 2010/02/15 (月) 09:20:46 - CJ 過去ログにもあるんですが、ＮＢＴ−ＢＣＩＰの発色産物はピンク色のものはアルコールに溶けますが、青のものは溶けません。 反応時に0.5%位Tween-20を加えてみると、反応産物は青の安定なものになります。 ところでＡＰって結構丈夫な酵素なので、２回目の反応時に１回目の反応が再開したりしませんかね…。私だったらＨＲＰ標識のやつでＴＳＡ-ＤＮＰ反応、さらにanti-DNP-HRPで反応してＤＡＢ反応に持ち込みます。色のコントラストもましなはずです。

double in situでのNBT/BCIP発色反応を止める方法 削除/引用 No.2089-1 - 2010/02/15 (月) 09:10:50 - toto xenopus初期胚をdouble in situ hybridizationで二重染色しています。 一次染色はアルカリフォスファターゼDIGラベルプローブでNBT/BCIPで発色して、二次染色はアルカリフォスファターゼFloラベルプローブでBM purpleで発色する計画です。 現在のプロトコールですと、NBT/BCIPの発色後0.2M Glycineで1時間washして反応を止めて、100％メタノールで脱水するのですが、NBT/BCIPの発色がメタノールで消えてしまいます。メタノールを入れた途端液が褐色っぽくなって、褐色だった染色が青色に変化しました（BCIPの染色は本来青色なのですよね？本実験では褐色の方が都合がいいので、特にこれは問題ではないです）。 BCIPはMEMFAで反応が止まるんですが、その後二次染色があるので、MEMFAで固定してもいいものかと迷っています。 どなたかNBT/BCIPでdouble in situしている方教えてください。

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