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(無題) 削除/引用 No.2087-12 - 2010/02/21 (日) 14:59:35 - aji キットでどの程度楽にしたいのかにも拠りますが、アルカリ法ベースのキットなら大丈夫ではないかと思います。GEの方でダメな理由が分かりませんが。 似たような状況で緑膿菌ではありませんが、QIAprep Spin Miniprep Kitで、プラスミドが大きい時には最後の溶出時に55度で暖めたミリＱや溶出バッファーを使うと回収量が大幅に改善されたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.2087-11 - 2010/02/15 (月) 14:46:53 - ky 大腸菌以外の菌で、大腸菌用プラスミド抽出キットを用いて抽出したことがありました。 アルカリ抽出法では抽出できましたが、キットでは全くという程抽出できなかったです。 その時は、大量かつある程度精製したプラスミドが欲しかったので、超遠心を用いた濃度勾配法を用いました。 サクッとをキットをあきらめるのも手かなと思います。

(無題) 削除/引用 No.2087-10 - 2010/02/15 (月) 11:22:19 - ~ 緑膿菌でアルカリSDS法で回収したら期待する量が回収できるのですか？ それが手始めに確認できることだと思います。

(無題) 削除/引用 No.2087-9 - 2010/02/15 (月) 10:49:17 - ats 大腸菌も緑膿菌もグラム陰性菌なのでアルカリSDS法は使えそうです。 ただし、カラム法での精製において大腸菌でも問題になるのがendA+（DNase)表現型株です。 大腸菌endA+株の対処法を探してみてはいかがでしょうか。たしかphenol抽出とかで残存DNaseを失活させろとなっていたような？ 辛口さんのコメントのように野生型のplasmidならコピー数が少ないことも大きな要因だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2087-8 - 2010/02/14 (日) 21:30:54 - 田村 本当にすみません。 返答ありがとうございます。 プラスミドサイズが大きいのでローコピーかもしれません。 普段キットで精製しないので分からないのですが、 ローとハイだとだいぶ精製に差が出てしまうものなんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2087-7 - 2010/02/14 (日) 21:11:03 - 辛口 これはまたずいぶんな後出し情報ですね。 緑膿菌を扱った経験はないので的外れかもしれませんが、プラスミドのコピー数が大腸菌に比して低すぎるというようなことはないのですか。

(無題) 削除/引用 No.2087-6 - 2010/02/14 (日) 20:48:55 - 田村 すみません。 書き方が悪かったです。 申し訳ありません。 えっと、緑膿菌株からのプラスミド精製を行いたいと思い試しました。 プラスミドサイズは20Kbくらいです。 GEヘルスケアのキットには35kb以下までは精製可能と書かれていたのでためしてみましたが、まったく回収できませんでした。 大腸菌以外では回収できないのかなと思ったりするんですが、どうでしょう？ 他にもわけがあるんでしょうか？ 大腸菌での回収はうまくいっているので、操作は間違えていないと思うんですが・・・。 すみません。 ご助力お願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2087-5 - 2010/02/14 (日) 20:43:43 - 田村 返答ありがとうございます。 キットの使い方は間違えていないと思います。 他の大腸菌で精製を行ったときにはうまくいったので。 持ち込みの菌量も指定どおり行っているのですが・・・。 最初は大腸菌株ではないから精製できないかと思ったのですが・・・。 カラムのせいってことはないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2087-4 - 2010/02/14 (日) 20:40:25 - 辛口 「上手くいく」は一通りですが、「上手くいかない」には千通りあります。どう上手くいっていないのかを書かないとコメントのしようがありません。

(無題) 削除/引用 No.2087-3 - 2010/02/14 (日) 20:28:56 - ~ まずはキットの使い方を間違えていることを疑ってみてはいかがでしょうか。 指示通りに試薬の調整や希釈は出来ていますか？ キットをケチって、推奨以上の菌量を持ち込んだりしていませんか？ また、キットのトラブルシューティングには、 回収率が低い、あるいは全く回収されない 場合などの原因と対処方法が書かれていますよね。 それに従って、まずは各ステップの画分に含まれるプラスミド量の確認を行ってみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2087-2 - 2010/02/14 (日) 18:58:02 - ami なんでだろう･･･

プラスミド精製キットがうまくいかないです 削除/引用 No.2087-1 - 2010/02/14 (日) 18:37:58 - 田村 プラスミド抽出を簡単に行いたいと思い、Qiagen（Quickyse Miniprep Kit)とGEヘルスケア（illustrate plasmidPrep Mini Spin Kit)で精製してみたんですがうまくいきません。 アルカリ溶菌法ではうまくいくんですが…。 なぜでしょうか？

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