全4件 ( 1 〜 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

PCRの再現性がとれません 削除/引用 No.2084-4 - 2010/02/15 (月) 19:46:48 - RO ぶん様、AP様、ご回答頂きありがとうございます。 お返事が遅れまして申し訳ございません。 >ぶん様 「一回目は全く凍結融解していないもの」を使用しておりました。昨日、改めて肝臓と他の組織をPCRしてみましたが、今度は両方ともPCRがかからなくなっておりました。AP様にご指摘頂いた通り、cDNAを水で希釈して保存したために分解を起こしていたと結論付けました。 大変初歩的なミスでお恥ずかしい限りです。ご回答頂きありがとうございました。 >AP様 URLを教えて頂きありがとうございました。私の検索が未熟なためこの回答を検索でヒットさせることができなかったようです。お手数をお掛けして申し訳ありませんでした。 ぶん様への回答の中でも述べましたが、結論としてはご提示頂いた掲示板上の答えが正しいようです。肝臓だけで特異的に分解しているように見えたのは、肝臓cDNAの量が他の臓器よりも非常に少なかったことが原因ではないかと考えております。 ご回答頂きありがとうございました。 皆様のご協力に大変感謝致します。 RO

ご参考 削除/引用 No.2084-3 - 2010/02/13 (土) 19:49:19 - AP http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=294

(無題) 削除/引用 No.2084-2 - 2010/02/13 (土) 19:45:37 - ぶん ちょっと確認なんですが、一回目は全く凍結融解していないもの 2回目は一度凍結融解したもの（つまり１回でも凍結したものが掛からない） ということで良いでしょうか？

PCRの再現性がとれません 削除/引用 No.2084-1 - 2010/02/13 (土) 19:28:41 - RO マウス胎仔肝臓から調整したRNAから作製したcDNAを用いてPCRを行っています。 内在コントロールとしてβ-actinのPCRを行っているのですが、PCR２回目からバンドの量が１／１０以下に減ってしまい、再現性がとれずに困っています。 ・１回目のPCRでは、プロダクトを10倍希釈しても十分見えるくらいの 　バンドが出ます。 ・１回目と２回目のPCR効率の違いは、β-actin以外の因子でも同様に 　見られます。 ・胎仔肝臓RNAからのcDNA合成は過去に２回行いましたが、毎回同じ現象が 　起きます。 ・１回目も２回目も、RT-ではバンドは出ません。 　（コンタミはしていない可能性が高いと思います） 凍結融解によるサンプルへのダメージが原因かと思い、cDNAを小分け保存してみましたが解決しませんでした。 サンプルの小分けは10倍希釈したもので、PCRにはその後一度も凍結融解していないものを使用しています。 脳など他の組織のcDNA(逆転写スタート時のtoalRNA量は同じ)では同じ方法で保存してもPCR反応に影響はありません。 「胎仔肝臓のcDNAが壊れやすい」と解釈してしまうのはあまりに短絡的かと思い、皆様がこの現象をどう解釈されるのかご意見をお伺いしたくトピックを立ち上げた次第です。 以下、現在行っているPCRの条件を示します。 ・polymerase → Go taq (プロメガ) ・cycle数 → 32 cycle ・template → 10倍希釈cDNA 2μl ・反応volume → 10または20μl ・PCR →94℃で2min処理の後、熱変成・アニーリング・伸長のサイクルを 　　　　繰り返します。（Go taq製品添付のプロトコル通りのプログラム） ・PCR mixの調整は常に氷上で行っています お忙しいところ大変恐縮ですが、ご教授賜りますよう宜しくお願い申し上げます。

全4件 ( 1 〜 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---