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(無題) 削除/引用 No.2064-3 - 2010/02/11 (木) 15:38:33 - TSSK エコエコさん 早速ご意見を頂き、大変嬉しく思います。 しかも解かり易い説明も頂き、なお感謝です。 trcがそんなにユルいものとは初耳でした…。 やはりコピー数の少ない、かつ発現制御のしっかりしたベクターを使わないといかんってことですね…。

(無題) 削除/引用 No.2064-2 - 2010/02/11 (木) 14:37:54 - エコエコ trcプロモーターって漏れやすい（IPTG入れなくても発現している）気がします。「IPTGを入れると過剰発現する」という性質と、「IPTGを入れないときは発現はゼロ」という性質は同義ではないです。trcは前者だと思います。 培地にグルコースを加えるとかで多少は漏れを防げますが、vectorのコピー数が多いと、漏れ出てくる発現量＞WTの発現量、ということもあると思います。 IPTGを入れた場合に見られた活性の低下ですが、御指摘のように増えすぎたSODが細胞毒性を示したと考えていいと思います。ただでさえ、WTより多いのにIPTGで叩いて数十倍になったら菌も大変でしょう・・・。 解決策としては、コピー数の低いvectorに変更する、trcではなくアラビノースプロモーターなどの厳しく発現制御でできるプロモーターにする、などがあると思います。

IPTG誘導について 削除/引用 No.2064-1 - 2010/02/11 (木) 13:45:34 - TSSK こんにちは。毎度勉強させて頂いています。 今回はpTrc系のプロモーターについてお伺いしたく思います。 pTrc99AベクターにSOD断片を組換えて大腸菌ミュータントに導入します。ここでの大腸菌ミュータントは、本来の大腸菌が持ち合わせるSOD活性をノックアウトしています（以下略：mut）。pTrc99AベクターはIPTG依存性です。 IPTGを加えず、組換え体mutよりタンパク溶液を精製してSOD活性を測定した結果、高いSOD活性を確認できました。それは本来SOD活性を持ち合わせた野生型大腸菌（以下略：wt）に勝るものでした。 IPTGを添加せずに、つまり誘導をかけずともpTrcの発現が行われているのは矛盾ですよね…。そういった機構にはどういう事が言えるのでしょうか？さらに、逆にIPTG誘導をかけると活性が落ちることがあります。IPTGの最適濃度や培養温度の他、SODの過剰発現によるインクルージョンや、サイトトキシック性もあり得るでしょうか？ ご意見いただけると嬉しいです。 宜しくお願いします。

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