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論文 削除/引用 No.2056-27 - 2010/02/25 (木) 01:56:39 - Kanata 該当の論文は Kawasaki et al., Analytical Biochemistry 191, 332-336 (1990)です。 私の読み方が間違っていなければ、SDS-PAGEのレーンを切り取り、7時間酵素なしで100mM Tris-HCl(pH9.0)でインキュベートし、再度染色しています。 このとき、比較的小さめの蛋白質のバンドが薄れている、または消えています。 読み込みが浅いかもしれないので、ご指摘いただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.2056-26 - 2010/02/23 (火) 21:14:39 - 笑い男 >[Re:25] Kanataさんは書きました : > もう質問者の方はご興味ないかもしれないのですが、 > どうやら該当するらしい論文を見つけました。（ゲルから蛋白質が抜ける！？） > ・・・が、ご興味ある方、まだいらっしゃいますか？？？ 見つかりましたか！　まだまだ興味ありです！

(無題) 削除/引用 No.2056-25 - 2010/02/22 (月) 00:58:43 - Kanata もう質問者の方はご興味ないかもしれないのですが、 どうやら該当するらしい論文を見つけました。（ゲルから蛋白質が抜ける！？） ・・・が、ご興味ある方、まだいらっしゃいますか？？？

(無題) 削除/引用 No.2056-24 - 2010/02/11 (木) 10:15:49 - 中年 長く泳動すると泳動の方向とは直角（横向き）にバンドが広がるのは正に拡散によるわけですから、その程度の拡散はあるということでは。

(無題) 削除/引用 No.2056-23 - 2010/02/10 (水) 23:08:41 - Kanata Cさんが書いていらっしゃるのに同意です。 私も重力とは思いませんし、拡散も非常にゆっくりだし効率も悪いと思いますよ。挙げた論文(1980年）でも48時間かけてますし。 ただ、Rさんおっしゃるところの「やってみたらどう？」には賛成です。 そこからわかることは実感を伴うことなので、大事だと思います。 それと、アクリルアミドゲルであっても、架橋度を変えればゲルからのすり抜け方は変わると思います。一般的には2.7%Tだったはずですが、これを大きくするとリン酸化蛋白の分離（移動度の違いで分離）に役立ちます。 笑い男　さん、というわけで架橋度を調べると大体の大きさがわかるのでは、と思うのですが。それと、件の論文ですり抜けた蛋白質は分子量30K 具らいだったと思います。（ちょっとあやふや）10万以上の大きなものではありません。このあたりからも、拡散は蛋白質の物理化学的性質に影響を受けていると考えられます。

(無題) 削除/引用 No.2056-22 - 2010/02/10 (水) 22:18:14 - 笑い男 >[Re:20] Kanataさんは書きました : > 論文、ちょっと探してみます。 > なにせ昔の話なので・・・。 　Kanataさん返信ありがとうございます。こちらでも探して見ますので、片手間程度で結構ですよ。 　いやー都市伝説というのは言いすぎかなーと反省もしております。実際には、ゲルからの拡散は起こりうると考えていますが、現実問題として拡散に起因するかもしれないトラブルには遭遇したことが無いもので。ゲルから出ていくでーっと噂されているほど、その速度は速くないんだろうなーーぐらいの感覚を都市伝説と表現してしまいました。 　話は変わってしまいますが、アクリルアミドゲル（10％として）の穴の大きさ？メッシュ？隙間？ってどのぐらいの大きさになるのか？だれか情報をお持ちではないでしょうか？また、チップ電気泳動みたいなナノピラーの間隔とかでも情報をお持ちではないでしょうか？ 体の小さい人の方が障害物競走で有利だから早く進めるんです！なんて例えてみたりもしますが、どの位の障害物を潜り抜けてるのかなー？という素朴な疑問です。

(無題) 削除/引用 No.2056-21 - 2010/02/10 (水) 22:03:25 - c 重力じゃないと思う。既に指摘があるように毛管現象とかで液が一方に動く時にそれに乗ってある程度蛋白質も動くということはあると思うしRNAのノザンとかそういう原理を利用してるとおもう。重力で蛋白質がゲル中を移動してゆくというのは考えづらい。ゲル内での蛋白質の拡散についてはアガロースゲルとかで電気泳動するときは起こりやすいかもしれないけど、アクリルアミドの場合は細かい編み目のなかに閉じ込められていて、拡散は簡単には起こりにくいようなきがする。activity gelとかの実験でゲル内で酵素反応とかさせる時、反応液中で数時間37Cでインキュベートしたりしたけど、後でゲルをCBBで染色しても拡散しているようには見えなかった。もちろん程度問題だから３日も４日もやったら拡散してくるかもしれないけど。

(無題) 削除/引用 No.2056-20 - 2010/02/10 (水) 20:53:09 - Kanata 笑い男さん 論文、ちょっと探してみます。 なにせ昔の話なので・・・。 80~90？年代の論文でDLできなかった記憶があるのと、目的が蛋白質の拡散ではなかったので、見つからなかったらご容赦ください。 正直に言うと、話半分で読みました。なぜなら振とう後にCBB染色してバンドの濃さを比較しているだけだったからです。もしもBufferから蛋白質が検出できたら（感度からすると難しいでしょうね）説得力があったのですが。 話題になっている重力（？）で膜に転写の件ですが。 私自身試したことはありません。 プロテオミクスを始めた頃、原理を知ろうといろんなテキストを読み漁ったときに、”拡散法”としてゲルとNC膜を重ね、ろ紙やフォームパッド、硬い網で順にはさみ、トランスファー緩衝液に48時間浸すという方法を目にしました。 Bowen B et al., Nucl Acids Res 8,1 (1980) 日本語では東京化学同人から出ている生化学実験法11・エンザイムイムノアッセイに紹介されています。 時間もかかれば効率も悪いでしょうから実際的とは思いませんが、みなさんいろいろ工夫されたんでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.2056-19 - 2010/02/10 (水) 15:20:31 - びっくりしました。 すでにご紹介の以下は、検出効率が膜よりもいいようで、とても面白いですね。 http://www.thermoscientific.jp/bid/pierce/immunodetection/western-blotting/in-gel.html ＞in gel westernについては、LI-CORのOdysseyを使った系もあるようです。 http://biosupport.licor.com/index.jsp?m=Proteomics&menu=Applications&spec=In-gel_Western によると、特別な試薬はいらないようで、これで検出効率が同じか、より高めなら、十分考慮に値します。私には。 ＞これってそもそもメンブレンに必ず転写しなければならないものなのでしょうか？ そうではない、というのが正しい答えのようで、びっくりしました。

(無題) 削除/引用 No.2056-18 - 2010/02/10 (水) 13:23:29 - Q 浸透圧っていうか、毛細管現象じゃ？

(無題) 削除/引用 No.2056-17 - 2010/02/10 (水) 12:04:42 - @.,/"$%\ >[Re:12] Rさんは書きました : > ゲルを逆さまにして一晩でもいいからやってごらんよ。 > おお〜っ重力って思うから。 SORE MAJIDESUKA?

(無題) 削除/引用 No.2056-16 - 2010/02/10 (水) 11:02:31 - 中年 固定していないゲルからのタンパク質の拡散は当然あるでしょう。電場を掛ければタンパク質はゲル内で移動できるんですから。ただ、重力に従ってタンパク質が下に動くってことはありません。溶液中だってタンパク質を沈降させようと思ったら超遠心が必要です。 in gel westernについては、LI-CORのOdysseyを使った系もあるようです。 http://biosupport.licor.com/index.jsp?m=Proteomics&menu=Applications&spec=In-gel_Western ただし、抗体は二価なので平面上に抗原が集積している方が感度がずっと高いということはあるでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.2056-15 - 2010/02/10 (水) 07:03:40 - Boston 電流をかけない状態でのゲルから膜への転写は、単に浸透圧の問題だと思います。サザンブロットがその例です。アクリルアミドとアガロースとでは、全く効率が異なると思いますが。 あとすでにご指摘の方がおられますが、SDS の影響は馬鹿になりません。転写の際、タンパク質に結合した SDS は解離し、タンパク質のリフォールディングのプロセスがおこると聞いた事があります。当然、抗体の反応性にも影響してきます。個人的には、３０分で転写が終わるセミドライが大好きです。

(無題) 削除/引用 No.2056-14 - 2010/02/10 (水) 01:36:38 - ？ 電気泳動後にやっている作業の意味を知っていらっしゃいますか？ メンブレンに転写せずにゲルのままでって応用する前に、今やっている作業の意味を知らないってどうなのでしょうか。 ゲルの固定っていうのは、普段やっている作業に既に、タンパク質が流れ出さないような過程があるということです。 ＞先輩に「あまり洗浄時間が長すぎるとタンパク質がゲルから流れ出てしまう」 私の書き込みの意味は、ひとつひとつの作業の意味がわかっているのなら、その過程を踏んでいるのなら、そんなこと考えなくても良いということでした。

(無題) 削除/引用 No.2056-13 - 2010/02/10 (水) 01:30:03 - R ゲルからの拡散に加えて、 固定したら抗原はどうなるのでしょうか？ その他諸々ありますが、先人の知恵は結構奥が深いですよ。

(無題) 削除/引用 No.2056-12 - 2010/02/10 (水) 01:23:49 - R だから、やってみればいいじゃん。 ゲルを逆さまにして一晩でもいいからやってごらんよ。 おお〜っ重力って思うから。 やれば分かるし、やらなきゃ信じられないでしょ？ 実験ってそういうもんでしょ。 そういった点を考慮ないし克服した製品はあると思います。 でも、自分で経験した方がすっごい身につくと思います。 こういう素朴な疑問は特に。 (自分でやってみれば自分なりの考察ができてためになりますよ) 酔ったおっさんの戯れ言です。

(無題) 削除/引用 No.2056-11 - 2010/02/10 (水) 00:44:00 - 笑い男 >[Re:1] まささんは書きました : > SDS-PAGEのゲルに直接抗体を反応させた場合、多少感度が悪くなりつつも > 一応は検出できるのでは……と思ってしまいます。 　私は出来ると思います。ただし、まささんが記載されているように感度のとノイズは懸念点ですが。操作の工夫をすれば妥協できるラインまでクリアできそうな気がします。 　というのも、下記ＡＰさんがきさいされているピアスの商品を気に留めていた（ただ、使ってみよう！とまでのメリットを感じなかったので、購入には至ってませんが。） >[Re:6] APさんは書きました : > In-Gel Westernと言う方法はあることにはあります。検索してみてください。 たとえば、http://www.thermoscientific.jp/bid/pierce/immunodetection/western-blotting/in-gel.html 　抗体のゲル内への進入？ゲル内への拡散？ゲル内での認識？に対しては、ゲルをイソプロなどで処理することがkeyらしい（特許によると）ので、Fabみたいに小さいのを処理して・・・・検出できてもいいような。 >[Re:9] Kanataさんは書きました : > 昔、日本人研究者の方の論文で「SDS-PAGE後のゲルをバッファー内でしんとうさせたところゲルから蛋白質が出てきた」というのを見たことがありますが、あとにも先にもその一報限り、しかもかなり長時間かけてやっていて、バンドが薄くなりました、程度のことでした。 >[Re:10] Rさんは書きました : > (一晩振とうとか) > クマシーで染めてみたら体感して分かりますよ。 > (重力でも動くきますよ)> 　どこの論文だったか覚えておられませんか？紹介していただけるとありがたいのですが。 　実際にゲルからタンパクが抜ける現象を経験されているのですね。詳しく書いていただけるとありがたいです。というのも、タンパクが拡散（抜ける）するというのは都市伝説じゃないかなーなんて考えていたもので。そんなにゲル内のタンパクって動くんですね〜どんな風に動くのか教えていただきたいです。 > ？さんが書かれていますが、ゲルの固定のメカニズムを考えてみるとわかりやすいのでは。 　私は、？さんがどっちの考えなのか読み取ることが出来ませんでした。 固定すればゲル内ウェスタンも可能と言っているのか、固定したといってもゲルと共有結合しているわけでもないので、結局は拡散してしまってゲル内ウェスタンは無理じゃないかなーとおっしゃられているのか・・・・。

(無題) 削除/引用 No.2056-10 - 2010/02/09 (火) 23:44:01 - R 抗体は入れずにウェスタンするのと同じ過程をゲルに課して (一晩振とうとか) クマシーで染めてみたら体感して分かりますよ。 (重力でも動くきますよ) 他人に聞くより自分で試すのがためになります。 経験が大事ですよ。 (その後の考察が後に活かされますよ)

(無題) 削除/引用 No.2056-9 - 2010/02/09 (火) 20:07:07 - Kanata ゲル上で抗体液をどうやって反応させるか。 (場合によってはものすごく大量の抗体溶液が必要になりそうですよね） 相当の分子量である抗体がどうやってゲルの中に浸透していくのか。 （簡単に浸透するのであれば逆も可、ゲル内の蛋白質もゲルの外に出て行きますよね）膜であれば表面に蛋白質が存在するので反応しやすいでしょう。 また、ブロッキングをどうするか。 膜への転写は100％ではないので、膜に転写させた方がバックグラウンドが若干抑えられる可能性もあります。（同じ原理は膜上でのOn-membrane digestion　で取り上げられることですね） ＞YOさん 昔、日本人研究者の方の論文で「SDS-PAGE後のゲルをバッファー内でしんとうさせたところゲルから蛋白質が出てきた」というのを見たことがありますが、あとにも先にもその一報限り、しかもかなり長時間かけてやっていて、バンドが薄くなりました、程度のことでした。 ？さんが書かれていますが、ゲルの固定のメカニズムを考えてみるとわかりやすいのでは。また、SDS−PAGEのメカニズムも。

(無題) 削除/引用 No.2056-8 - 2010/02/09 (火) 19:40:30 - ？ ゲルの固定って知っていますか？

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