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(無題) 削除/引用 No.2040-18 - 2010/02/08 (月) 17:37:55 - PDI 通常の付着用プレート（コラーゲン等の特殊処理無し）で問題なくトランスフェクションできてます。 やりかたは、 １）トランスフェクション時に70−80％になるよう、前日に細胞をプレーティング ２）pDNA＋遺伝子導入試薬溶液の添加時には、well(plate）を傾けて細胞に直接溶液が掛からないようにゆっくり添加 ３）3時間後に血清を含む培地を添加 これで24-72時間後の細胞を解析しますが、問題はありません。 既出かもしれませんが御参考までに。

(無題) 削除/引用 No.2040-17 - 2010/02/07 (日) 17:23:53 - MX あるラボからもらった"293T"と別のラボからもらった"293T"とで接着具合が全く異なるということはよくあることです。細胞がサブライン化してしまっているということです。はがれやすい性質をもった細胞をコラーゲンや poly-L-Lysinコートプレートを使って接着力を増して利用するのも一法ですが（要はトランスフェクション効率さえ保たれておれば），はがれやすいのが気になる，あるいは実験上都合が悪いというのであれば，素性のはっきりした継代数の比較的少ない細胞をバンクから購入した方がよろしいかと。しかしながら，mmさんのご意見はなるほどそういう方法で選択してみることができるのだ，と勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.2040-16 - 2010/02/07 (日) 00:46:34 - Eire HEK293Tは確かに剥がれやすいですね。 導入試薬は何を使っていらっしゃるのでしょうか？ 導入前に培地交換やPBSでの洗いを要求するものだと、その時に細胞が剥がれやすいので、293Tへの遺伝子導入時は培地交換の必要のない試薬を使っています。個人的には、とにかく高発現量が欲しい場合や、発現させにくい遺伝子を導入するときには Lipofectamine2000 を好んで使っています。DNAや試薬は添付プロトコールの半量で使っていますが（単にケチるため）、今のところ十分な導入、発現効率が得られています。また細胞は抗生物質の入っていない培地で培養する旨の指示がありますが、普通にペニシリン・ストレプトマイシン入りの培地を使っても問題は生じていません。DNAや試薬の希釈には指示通りOPTI-MEM I（血清、抗生物質なし）を使っています。 90-95%コンフルエントの細胞密度にするので、乱暴に扱うと細胞がディッシュ（マルチウェルプレート）からシート状に剥がれてしまうことがあります。ディッシュやプレートの移動はゆっくりと行い、トランスフェクションの際は溶液をdropwiseで静かに添加する、という点は気をつけています。ディッシュやプレートはコートしていない通常の培養用のものを使っています。 10cmディッシュや15cmディッシュ内の細胞にトランスフェクションするとき（分泌タンパクの回収時など）は、以前こちらで紹介された自家製ポリエチレンイミン（PEI）を使っています。圧倒的に低コストで、導入・発現効率もLipofectamine2000ほどではないですが（当社比）、けっこう良いです。

(無題) 削除/引用 No.2040-15 - 2010/02/06 (土) 13:31:50 - 、 invtrogenの293Aってのは、引っ付きやすい293を集めてきたものですよね。確か。 アデノ作製用ですが。

(無題) 削除/引用 No.2040-14 - 2010/02/06 (土) 09:58:04 - UK HEK293とHEK293Tを使っています。確かに、293はとてもはがれやすいです。しかし、同じplateやdishで何回か継代すると、細胞が底面になじみやすくなるのか、剥がれ難くなります。コラーゲンコートを頻繁に使うのが、もったいない時に有用です。

(無題) 削除/引用 No.2040-13 - 2010/02/05 (金) 02:20:13 - mm ２９３や２９３Tは剥がれやすくて、使いづらいので乱暴の方法ですが、下のようにしている人がいました。 毎日、Dishのそこを叩いたり、Dishを揺らしたりして、はがれやすいものをはがれさして、その後Mediumを変える。こうやっているうちに、くっつきのいい細胞にSelectされて、非常に扱いやすくなってます。変なSlectionがかかるかもしれませんが、現在のところ問題ないようです。

(無題) 削除/引用 No.2040-12 - 2010/02/05 (金) 00:53:25 - モモ poly-L-lysineコートをすでに使っていらっしゃるのなら、十分だと思います。細胞数は数えてないのですが、トランスフェクションの２日前に薄くまいて、トランスフェクション時に５０−７０％になるにします。トランスフェクションして４８時間以内に回収してオーバーコンフルエントを防ぎます。

(無題) 削除/引用 No.2040-11 - 2010/02/04 (木) 23:45:40 - 遺伝子導入初心者 相互作用さん ありがとうございます。 fusine6というのは使用したことがありませんでしたので、それに関する知識はありませんでした。 とても参考になりました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2040-10 - 2010/02/04 (木) 22:46:08 - 相互作用 翌日、５０％−７０％コンフルエントになるようにしています。細胞数は数えてさえいません。 じつは、私はFugene 6なので、血清存在下、ばらばら、浮遊状態で直、トランスフェクトしてますが、、、よくトランスフェクトされてます。 >薄くまき過ぎるとやはり剥がれやすいですよね… そうでもないですね。トランスフェクトにPBS洗浄などが必要で、そのときにやさしくやってもはがれるのでしたら、どうもなんらかの理由で私の経験とは違うようです。Fugene 6は特に、上のような感じで使えますので、、、はがれることは私は問題ありません。

(無題) 削除/引用 No.2040-9 - 2010/02/04 (木) 22:11:13 - 遺伝子導入初心者 相互作用さん >蒔いたとき細胞は、一個一個バラバラになっていますか？ポイントは、おそらくトリプシン処理の長さではなく、トリプシン+ピペッティングで蒔いたとき細胞がかたまりなっていないということです。 ありがとうございます。 顕微鏡下での鏡検ではsingle cellになっています。 だいたい6 cm dishや3.5 cm dishにまく際の密度はそれぞれどれほどでしょうか？ 薄くまき過ぎるとやはり剥がれやすいですよね…

(無題) 削除/引用 No.2040-8 - 2010/02/04 (木) 21:50:19 - 相互作用 ＞確かにHEKはトリプシンで剥がれやすいので3 minというのが過剰だったかもですね。 蒔いたとき細胞は、一個一個バラバラになっていますか？ポイントは、おそらくトリプシン処理の長さではなく、トリプシン+ピペッティングで蒔いたとき細胞がかたまりなっていないということです。 私はDishは普通の細胞培養用のDishで特別にコーティングしていません。

(無題) 削除/引用 No.2040-7 - 2010/02/04 (木) 21:38:14 - 遺伝子導入初心者 相互作用さん トリプシンの処理時間は細胞ごとで変えず3分と固定していました。 確かにHEKはトリプシンで剥がれやすいので3 minというのが過剰だったかもですね。 ありがとうございます！！どんどん改善できたらと思います><。

(無題) 削除/引用 No.2040-6 - 2010/02/04 (木) 21:34:01 - 相互作用 dishの材質は、気にしなくて大丈夫な場合もあると思います。 はがれてしまった場合でも、そうでない場合でも、PBS＞トリプシン（１−３分長くやり過ぎない）＞培地添加＞ピペッティングで細胞を一個一個バラバラにします。 これを蒔いてやるとdishによくくっつきます。細胞ー細胞相互作用のほうが細胞ーdish相互作用より強いのかな~~~といつも思っています。

(無題) 削除/引用 No.2040-5 - 2010/02/04 (木) 20:49:33 - 遺伝子導入初心者 みなさまありがとうございます。 私どもは普通にpoly-L-lysineコートdishをそのまま使っていました。 コラーゲンコーティングするんですね！！ 大変貴重な情報をありがとうございます。 他にもう少し安価な方法でcoatingされている方がお見えでしたら教えていただけますと幸いです。 ゼラチンなどでもcoatingできるのでしょうか？ コラーゲンは私どものlabでは貴重なもので中々手が出せずにいます。。

(無題) 削除/引用 No.2040-4 - 2010/02/04 (木) 20:38:38 - mom-a どういう操作をして、剥がれてしまっているのでしょう？ その辺の記載がないので、もしかしたら既にやっておられるかもしれませんが、 １）コラーゲンコートdishを使う。（モモさんと同意見） ２）メディウムは予め37℃にあたためておく。 というあたりでしょうか。 最近使っていないので、細胞密度等の条件を忘れています…。

(無題) 削除/引用 No.2040-3 - 2010/02/04 (木) 20:32:21 - モモ コラーゲンコートのディッシュを使っていたことがありますが、 細胞は剥がれにくかったです。おすすめです。 今いるラボにはコラーゲンコートのディッシュがないので、 細胞を蒔いてから２４時間以上待ってからトランスフェクションする。 オーバーコンフルエントにならないようにする。 細胞回収時は手早くかつジェントルに扱う。 などに気をつけてます。

(無題) 削除/引用 No.2040-2 - 2010/02/04 (木) 18:05:42 - 遺伝子導入初心者 それから細胞の密度なども教えていただけますと幸いです。 ちなみに遺伝子導入後、2-3日後に、回収してWBを行う予定です。

HEK293Tが剥がれてしまいます 削除/引用 No.2040-1 - 2010/02/04 (木) 18:04:33 - 遺伝子導入初心者 みなさんにお聞きしたいことがあります。 現在、HEK293細胞をdishにまいて、リポフェクション法による遺伝子導入を試みているものです。 しかし、細胞がとても剥がれやすく、困っています。 みなさんは、HEKを利用した遺伝子導入の際にどういったことを気にされていますでしょうか？ dishの材質やcoatingなども気にされたりするのでしょうか？ どうか教えてくださいm(__)m

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