全13件 ( 1 〜 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2037-14 - 2010/02/04 (木) 20:37:32 - Pumpkin 共沈剤というのは、NaOAcとかの塩でなくてグリコーゲンなどの沈殿補助剤のことですよ。 insituさんの言うようにアガロースゲルの持ち込みかなぁっとも思ってたのですが、切り出していないようですし、多糖っていっても制限酵素消化の後には入らないんですよね。グリコーゲンの入れすぎ＋乾燥させすぎを疑ったんですが、これも違うと。

(無題) 削除/引用 No.2037-13 - 2010/02/04 (木) 15:07:19 - えっ in situ様 ありがとうございます。 実は、TEだけでなく、滅菌水でも溶かしてみましたが 溶けませんでした。 多糖類が多く含まれているのでしょうか・・・ どこで混ざったのかわからないですが。

(無題) 削除/引用 No.2037-12 - 2010/02/04 (木) 15:05:38 - えっ 中年様 ありがとうございます。 フェノクロが不十分ですか。フェノクロを作り直した 方がよいのかもしれませんね。 ゲノムDNAの時のエタ沈の時も、3M NaOACを入れております。

(無題) 削除/引用 No.2037-11 - 2010/02/04 (木) 15:04:16 - えっ mom-a様 ありがとうございます。 私も、白いカス状の原因はフェノクロ→エタ沈のところが問題と思って おります。 DNAの回収率は、制限酵素で切断する前のDNA量と、切断して フェノクロ、エタ沈後のDNA量を比較して、回収率を出しております。

(無題) 削除/引用 No.2037-10 - 2010/02/04 (木) 14:40:34 - in situ TEで溶かしたときというのが気になります。 自分も同じように白い沈殿が生じたことがありますが、その時は多糖類（組織からの抽出やゲル抽出の際のアガロース）を多く含むDNAもしくはRNA溶液に過剰にイソプロやエタノールを加えたときでした。 確かに、その時は極端に収率が下がってやり直しましたが、それではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2037-9 - 2010/02/04 (木) 14:04:48 - 中年 フェノクロ抽出が不十分で制限酵素からの何かの持ち込みがあるのではないでしょうか。 ところで、ゲノムDNAのEtOH沈殿のときにも共沈剤を入れてるんですか。

そんなばかな 削除/引用 No.2037-8 - 2010/02/04 (木) 14:02:19 - mom-a 失礼しました。 フェノクロ-エタ沈ですね。 いずれにせよ、プラスミド抽出してイソプロ沈→ペレット溶解、まではOKということなら、白いカス状のものの原因はその後のフェノクロ→エタ沈のところが問題なのではないでしょうか。 DNAの回収率は、酵素処理前の時点で確認しているのですか？

(無題) 削除/引用 No.2037-7 - 2010/02/04 (木) 13:57:42 - mom-a >問題は、溶かしたDNAを制限酵素で切断し、エタ沈をした後、TEで溶かした時に白い析出物がでてきます。 ざっくり書いてありますが、酵素処理した後、そのままエタ沈しているということですか？

(無題) 削除/引用 No.2037-6 - 2010/02/04 (木) 11:57:36 - えっ Boston様 ご回答ありがとうございます。 そうですね、確かに白い析出物を回収率低下の原因に するのは、不確かでした。申し訳ございません。 一部ゲルに流して確認し、アルカリ処理にも気をつけて みようと思います。 参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.2037-5 - 2010/02/04 (木) 11:53:22 - えっ Pumpkin様、ご回答ありがとうございます。 説明不足でしたが、KitのカラムでDNAを抽出した 後は、イソプロ沈でDNAをペレットにしています。これは kitの説明書に従って行っております。 ペレットのDNAを水に溶かした時は、何の沈殿物もなく、 きれいに溶けます。ペレットのDNAが乾燥しないようにも 気をつけております。 問題は、溶かしたDNAを制限酵素で切断し、エタ沈を した後、TEで溶かした時に白い析出物がでてきます。 まあ確かに調べた訳ではないので、白い析出物のせいという 根拠もないのですが… エタ沈の時に入れる共沈剤に原因があるのかと思いましたが、 kitを使わずに細胞から抽出したゲノムをエタ沈した時は白い析出物が 出なかったので、問題ないのではないかと考えております。

(無題) 削除/引用 No.2037-4 - 2010/02/04 (木) 11:50:15 - Boston >この白いカスのせいで、DNAの回収率がガクっと下がってしまいます。 白いカスのせいで、DNA の回収率が下がるという点は不確かだと思います。一部、ゲルに流して、genomic DNA のコンタミがないかどうか、確認する事をお薦めします。アルカリ処理で、genomic DNA は切断されて、コンタミし易くなります。私は、５回ほどチューブを invert したら、すぐに中和します。

(無題) 削除/引用 No.2037-2 - 2010/02/04 (木) 11:26:48 - Pumpkin EtOH沈殿のあとに乾燥させすぎていませんか？もしくは、必要以上にグリコーゲンなどの共沈剤を入れていて、同じように乾燥させすぎていませんか（特に真空乾燥機とかで）？ほとんどの場合、こうなると温度をかけても溶けませんが、実際にはそういう理由でなくて、その程度の量しかとれなくて当たり前だけどなんか析出しているから収量が減っていると思い込んでいるだけととかありませんよね。要は、その「白い析出物のせい」で収量が下がっているという根拠がわからないもので。 Macherey-Nagel社のキットを使ったことがありませんが、抽出したplasmidをEtOH沈しても析出物がないなら、その後のステップの問題だと思います。

DNAの回収率が悪い 削除/引用 No.2037-1 - 2010/02/04 (木) 11:06:11 - えっ 質問があります。 Macherey-Nagel社のmidi kitを使って、大腸菌から プラスミドを抽出しているのですが、抽出したプラスミドを 制限酵素で切断して、フェノクロ、エタ沈した後にTE bufferで 溶かすと、白いカスみたいなのがでてきて、これがどうやっても 溶けません。50℃で10分ほど置いてボルテックスをしても 溶けませんでした。 この白いカスを出さずに、DNAを溶かす方法をご存じの方は おられますか？この白いカスのせいで、DNAの回収率が ガクっと下がってしまいます。 ご教授お願い致します。

全13件 ( 1 〜 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---