全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2028-8 - 2010/02/04 (木) 23:20:56 - CBB 抗体で染めてそのタンパクか確認するのが確実なのですね。 今回譲渡していただいたプラスミドがタグなし（pcDNA3.1(+))で目的タンパクの抗体を持っていなかったため購入を躊躇しておりました。 抗体の購入を検討します。 皆様メッセージありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2028-7 - 2010/02/04 (木) 12:34:25 - c 他の方もすでに書かれているように、動物培養細胞に遺伝子を導入して強制発現させて細胞のライゼートを電気泳動しても、その蛋白質がCBBでわかるほど発現する事は一般的にはほとんどないと思います。大腸菌でリコンビナントを発現させたときとはかなり様子が違います。（タグ付き蛋白質ならば、アフィニティカラムで部分精製してようやくそれっぽいのがなんとか見えるかどうかという感じです。） 蛋白質のアプライ量を増やしてもそれに応じて他の蛋白質も増えるから、相対的な量比は変わらない訳で、分離や見かけが悪くなるだけでいい結果は期待出来ないと思います。よって、発現については、発現させた細胞、発現させてない細胞のライゼートそれぞれを電気泳動して、ウェスタンブロッティングで確認しています。ゆえに調べたい蛋白質の抗体または（タグ付きならば）タグに対する抗体が必要になります。 トランジエント発現だと、導入してからの時間も重要なので、予備実験として12, 24,36,48hくらいの各点でサンプリングして比べて、どの辺が一番よさそうかはじめにチェックした方がいいです。細胞の種類が変わるとうまく発現しない事もときどきあります。時間を有効に使うためにも、譲渡先のラボから具体的な実験に関する既知情報をよく聞いておくのが一番良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.2028-6 - 2010/02/04 (木) 11:29:57 - frap 否定的な意見も出ていますが、「もの」によります。 例えば経験上、EGFPなんかをトランスフェクション効率の良い細胞、条件で発現させればCBBでも確認出来ます（他のタンパク質でも経験有り）。 ただし結局増えていそうなバンドが有ったとしてもそれが本物か？というとやはりWBしてみない事には、、、 ですので、これまでにCBB上で発現が確認された＝OK 確認されない＝ダメ とした事はありません。 やってみてもよいのかもしれませんが、定石は（SDS-PAGEを使っての確認という流れでは）やはりWBだと思います。 またアプライ量に関しては>>cさん同様、多すぎだと思います（ミニゲル、10wellでは）。なんだったら幾つか希釈系列を振って流してみては如何ですか？

(無題) 削除/引用 No.2028-5 - 2010/02/04 (木) 11:06:58 - けい トランスフェクションしてCBBで検出したことがないのでなんとも言えませんが、 培養細胞へトランスフェクションした場合、 通常はウエスタンで検出するぐらいの発現レベルではないでしょうか？ CBBとウエスタンだったら、感度は比較にならないぐらいウエスタンの方が良いです。

(無題) 削除/引用 No.2028-4 - 2010/02/04 (木) 10:50:20 - PDI 哺乳細胞の一過性発現で、ＣＢＢにて目視出来るほどの発現量は期待出来ないと思います。 目的タンパクの抗体を購入してウエスタンブロットするべきだと思います。 タグが付いていれば抗タグ抗体でもＯＫです。

(無題) 削除/引用 No.2028-3 - 2010/02/04 (木) 08:49:25 - CBB ｃさん ありがとうございます。 私が行っているのは通常の一次元の電気泳動です。 以前10wellのミニゲルに各サンプルを20ug泳動したのですが、トランスフェクションしたものとしていないcell lysate間で目的サイズ付近のバンドの濃さに違いが見られませんでした。総タンパク量が少ないのかそれともトランスフェクションがうまくいっておらず目的タンパク量が少ないのか悩んでおりました。ｃさんは8〜15ug/laneの泳動で目的タンパクの確認が出来ておりますか？

(無題) 削除/引用 No.2028-2 - 2010/02/04 (木) 02:35:44 - c 通常の1次元SDS-PAGEで、ミニゲルで120μgはかなり多すぎるような気がします。細胞抽出液などクルードなサンプルの場合は8〜15μg/laneくらいでやってますが、よく本とか製品の参考データとかに出てるような感じでたくさんバンド見えます。 ２次元電気泳動（２次元目はミニゲル）の場合ならば120μgは妥当な範囲とおもいます。

CBB染色 削除/引用 No.2028-1 - 2010/02/03 (水) 09:48:48 - CBB こんにちは。 他のラボから譲渡していただいたプラスミドが働くか確認するため、COS7細胞にトランジエントトランスフェクションしタンパクをSDS-PAGEで電気泳動後、CBB染色で強制発現させたタンパクの大きさを確認したいと思っています。目的タンパクの抗体は持っておりません。 バイオ実験イラストレイテッドによると「無数のバンドがあると思われるサンプルはミニゲルの場合各レーンに約120ug入れるとよい」と書いてありますがそれぐらい必要なものなのでしょうか？私が通常得るcell lysateは1ug/ul程度なので相当濃縮しなければその量を入れられません。トランスフェクションの効率、ベクター、タンパクの種類にもよると思いますが皆様の経験など教えていただければ幸いです。

全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---