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(無題) 削除/引用 No.2026-9 - 2010/02/03 (水) 13:46:01 - ごんべい 皆様ありがとうございます。 Kanata様の仰ることは最もですね。検出感度を決定しているファクターはもちろん一つではないですよね。その点作戦は慎重を要しますね。 私もtag様の仰る様な流れを想定していました。やはり内因性のものから取りかかるのは無理だと想定していました。検証実験はもちろん必須ですよね。たくさんのpotential targetsの中から注目する候補を絞る手段の一つとして、偽としてでやすいものが分かったらいいと思ってお伺いした次第です。もちろん、そのようなタンパク質としてリストされているから本物の結合が否定されるわけではないと言うことは理解しています。

(無題) 削除/引用 No.2026-8 - 2010/02/03 (水) 12:24:42 - tag 内在性のものでのIPは仮にうまくいっても抗体の制限もあり量的な面でかなり厳しいことが多いですね。銀染では見えてもクマシーだと何も染まらないとかよくありますね。タグ蛋白質強制発現の問題ですが、たとえばそれでやって同定された蛋白質をとりあえずパートナー蛋白質候補（論文などではpotential targetsとかpossibleなんとか、とかいう言い方するみたいです）として表にまとめて、そのなかで興味のある蛋白質やほんとうのパートナーかどうかこれはちょっとはっきりさせたい蛋白質について抗体を購入して、pull-down assay (候補蛋白質に対する抗体でIP, もう一方の蛋白質に対する抗体でウェスタン、逆でもいいです。）で生理的な条件下でも相互作用してるかどうかを判定するというやり方があると思います。ウェスタンなら感度的にもIPの回収が低くてもなんとかなることも多いので。論文には強制発現に伴うアーティフィシャルな相互作用の可能性も否定出来ないけれど、すくなくともpull-downでバリデーションした蛋白質は本当の（さっき``potential---``に対して``bona fade---``という言い方をするみたいです）パートナーであることがわかりましたみたいな風に書けばどうでしょうか。他のものは今調べ中みたいな感じでまとめられるのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2026-7 - 2010/02/03 (水) 08:34:30 - Kanata MSでの蛋白質の同定には、ご存知のようにサンプル調製の長いステップが必要になります。装置自体の感度はこの7−8年で良くなっていますし、微量蛋白質の同定に有用なNano-HPLC　system, CHIP systemも普及しています。 　機器分析メーカー言うところの「チャンピオンデータ」だと、amolレベルで同定できることになりますが、それは市販の蛋白質を使ってのことです。 　お尋ねの「自信を持って同定できる量」に関しては、「蛋白質による・サンプル調製法による」としか言えないでしょう。どれだけの量、比率で内在蛋白質とそれに相互作用する蛋白質が存在するかは一律ではないですし、酵素消化における酵素の選択によって得られるペプチドの長さが変われば、蛋白質同定のProbabilityも変わってきます。 　というわけで、マシンの感度以上にサンプル調製（方針の立て方）が微量同定を左右する、という認識でいます。

(無題) 削除/引用 No.2026-6 - 2010/02/03 (水) 08:15:20 - ごんべい 皆様ありがとうございます。 すみません。言葉の問題というか定義の問題というか。タンパク質相互作用の偽陽性という方が正確でしょうね。 私の意味していることは、（もちろん過剰発現によるartifactに起因しているからだと思いますが）異なるタンパク質で釣っているにもかかわらず高頻度でとれてきて、実際内因性同士の結合が見られないようなものです。Y2Hの場合も「XXが取れてきたらそれはよく出てくる偽物だよ」ってよく言っていたような気がします。Hspに加えてribosomal proteinもよく出てきやすいと聞いたような気がしますが（誤っているかも知れません）。以前この様なタンパク質がリストされている表を見た記憶があるのですが、どこで見たのか思い出せずこちらに相談した次第です。 しかし、tagさんの仰るように内因性のタンパク質を使って勝負できると良いのですが。その場合今度は何にもでないと言うことになりかねませんしね。今皆さんはどれくらいの量があれば自信を持って同定までこぎ着けていらっしゃるのでしょうか（つまり感度は７，８年前に比べどれくらい良くなったということですが）？

(無題) 削除/引用 No.2026-5 - 2010/02/03 (水) 02:10:08 - み >[Re:4] Kanataさんは書きました : > それは”MSの”偽陽性とは言いがたいと思いますよ。 > MSが誤って同定しているわけではないでしょう。 指摘されて気付きましたが確かにそうですね。 質問者様が問題にされているのは強制発現によるartifactというべきでしょうか。

言葉の問題ですが 削除/引用 No.2026-4 - 2010/02/03 (水) 01:37:45 - Kanata それは”MSの”偽陽性とは言いがたいと思いますよ。 MSが誤って同定しているわけではないでしょう。 もちろん、Coverage,Probabilityによりますが。 ちなみにMSの偽陽性、となるとソフトウェアのアルゴリズムによるFalse Poitiveもあります。これもMSが、ではないですけれど。

(無題) 削除/引用 No.2026-3 - 2010/02/02 (火) 22:28:07 - み 内在性同士での確認実験。 機能的証明にかかっていますね。 14-3-3、HSP・・・・と言ってもfunctionalな相互作用かもしれない。

(無題) 削除/引用 No.2026-2 - 2010/02/02 (火) 22:19:56 - tag 偽陽性という用語が適切かどうか分かりませんが、タグ付きの過剰発現させた蛋白質で引っ張ってくるのは簡単でいいのですが、程度の差はあるけれどHSPs（70とか90とか25?とか)など分子シャペロン系の蛋白質群とか蛋白質分解系の蛋白質群が共精製されてくることはよくあります。たぶん細胞内でふだん見かけない蛋白質が急にたくさん現れたので、異常蛋白質として認識してなんとかしようとしているのだろうと思います。ただそれとは別に、その蛋白質がもともとほんとうにそうした蛋白質群と相互作用する可能性も否定出来ないので最終的な結果から除外するのがいいか入れた方がいいかは難しいです。 いい抗体がたくさんあって、内在性の蛋白質でIPでできれば一番いいのですが。

MSの偽陽性 削除/引用 No.2026-1 - 2010/02/02 (火) 21:47:53 - ごんべい 細胞に興味のあるタンパク質を発現させてタグなどで引っ張ってきて、co-purifyされるタンパク質をMSを使って同定することはよく行われていると思います。この場合よく見られるfalse positiveにHsp70が知られているようですが、その他どのようなものが有名でしょうか？

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