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勉強になりました 削除/引用 No.2025-9 - 2010/02/04 (木) 20:28:32 - WB toyoさん、cさん、Bostonさん、ありがとうございます。とても勉強になりました。 サンプルの調製方法とブロッティングの条件を改善したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2025-8 - 2010/02/04 (木) 11:02:20 - Boston 疎水性の高いタンパク質でも、SDS-sample buffer で大抵、可溶化できます。 以下は自分の経験談でないので、参考程度にして下さい。 タンク式は、高分子量のタンパク質の転写に向いていると言われています。同僚は、Cold Room、O/N で転写していました。ひょっとしたら、これで改善されるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2025-7 - 2010/02/04 (木) 11:00:34 - toyo cさんのコメントで思い出しましたが、Transfer Bufferの調節という点では、 SDS濃度に加えてメタノールの濃度なども検討の余地があります。 http://www.gelifesciences.co.jp/newsletter/protein_sciences/faq/faq0705.asp

(無題) 削除/引用 No.2025-6 - 2010/02/03 (水) 22:22:37 - c ウェスタンの場合は蛋白質の分子量や性質等により定量的に膜にブロットされないこともしばしばあります。（写りやすいものとそうでないものということ。）特に100KDaを越える高分子量のものだと転写が十分でなくて、ゲルにまだ残っているということはあり得ますので、そのために見かけ上Aと比べてBがとても薄いという可能性は考えられるとおもいます。高分子量蛋白質の転写の改善にはトランスフェアーバッファーに最終濃度0.01-0.05%くらいの範囲でSDSを入れるとか、転写時間を少し延長するなどの方法があります。ただ書かれている転写条件だとむしろ普通よりもかなり長いようにも思うので、後者のほうは当てはまらないかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.2025-5 - 2010/02/03 (水) 20:11:56 - toyo タンパクBがAより壊れやすいという可能性があると思います。 EDTAの副作用やプロテアーゼ阻害の不足などを考えると、10%TCAに 浸漬した状態で細胞を掻き取ったり、細胞にSDS Sample Bufferを 直接かけて可溶化することを検討してもよいかもしれません。 またタンパクBの疎水性が強くて凝集しやすい(溶けにくい)なら、 SB添加後のboilの代わりに低温で振盪してもよいかもしれません。 この掲示板でも何度も紹介されていますが、 http://www.ims.u-tokyo.ac.jp/ohmiken/Lab%E3%83%A1%E3%83%A2/memo%208.html http://www.ims.u-tokyo.ac.jp/ohmiken/Lab%E3%83%A1%E3%83%A2/memo%209.html あたりを参考にしてみてはいかがでしょうか。

なるほど！ 削除/引用 No.2025-4 - 2010/02/03 (水) 18:52:17 - WB モモさん、ありがとうございます。 そうなのかもしれません。 サンプルは以下のように作りました。 PBS/EDTAで細胞を回収 ↓ プロテアーゼ阻害剤を添加後、ソニケーション ↓ サンプルバッファー（SDS、glycerol、メルカプトエタノール等）を添加 ↓ 98℃で10分間 サンプルは遠心せずに、そのままアプライしました。

(無題) 削除/引用 No.2025-3 - 2010/02/03 (水) 00:29:27 - モモ WBのサンプルはどのように作りましたか？ 蛋白Bが溶けにくいのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2025-2 - 2010/02/02 (火) 21:37:50 - WB WBです。 書き忘れていました。 タンパク質AもBも免疫染色では核に局在していました。

免染では十分に検出できるがWBでは・・・ 削除/引用 No.2025-1 - 2010/02/02 (火) 21:26:34 - WB タンパク質の実験経験が少ない者です。宜しくお願いします。 タンパク質Aの分子量は40kDaで、タンパク質Bは120kDaです。AもBもN末にmycタグをつけています。myc抗体を用いた免疫染色では、どちらも十分に検出できました。しかし、WBを行ったところ、BのバンドがAに比べて5倍ほど薄かったです。どちらも分子量は正しい位置にありました。 いろいろ聞いて、試したのですが、WBでタンパク質Bを思うように検出できません。詳しい方がいましたら、どうぞ助けてください。 ちなみに、WBのサンプル調製の際には、プロテアソームとプロテアーゼ阻害剤を用いています。また、ブロッティングはタンク式を用いて250mAで4時間の条件で行っています。

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