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ありがとうございます 削除/引用 No.2011-12 - 2010/02/02 (火) 22:09:16 - ta 質問者です。 いろいろとご示唆いただき、感謝感謝です。 昔、ＧＳＴfusionが取れなかったときには、きっと変性、または分解しているのだと思い、どんどんマイルドなconditionに流れてしまい、最後に、実はソニケーションなどが甘すぎて可溶化していなかったのだ、という、逆の結論に達したことがあります。 可溶化されているのに、ビーズ結合しない、という問題も、もしかするとアグリゲートができていて、マイルドな条件より、detergent強化したほうが案外解決するのでは、という気もしてきました。 一般的なtroubleshootにも、可溶化の問題については多くの記述があるのに、ビーズに付かない問題はあまり書いてありませんね。ＧＳＴのみはくっついているので、ソニケーションによってＧＳＴ部分が壊れている、というのも考えにくいように思います。 あきらめるのは少し待って、とりあえずsonicationを変える、ＤＴＴ加える、可溶化は、温度やエアレーションで改善してサルコシルは減らす、という方向で試してみます。 重ねて、トピックへの書き込みありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2011-11 - 2010/02/02 (火) 20:44:21 - DTT ふーん。コントロールをきちんと取っているようですし、面白いですね（揶揄的な意味はありません）。 DTT、１０ｍMくらいで結合が改良される場合があります。 GSTである程度行きたいのでしたら、あとはスペーサーを間に入れる方法もあります。可能性のひとつにすぎませんが、立体障害ということです。MBPですでに示されている方法ですね。（GSTについてはあまり聞いたことがありませんが、、、）

(無題) 削除/引用 No.2011-10 - 2010/02/02 (火) 17:16:46 - がっくん かなりあります。 抗原用ならHis tagにしますね。あまりくだらない事で悩むのも時間の無駄かと。自分の経験上、さっさと発現システムを変えた方がよい場合がほとんどでした。

(無題) 削除/引用 No.2011-9 - 2010/02/02 (火) 15:47:28 - window 私も同じような経験があります。 GSTのみであれば、効率よくグルタチオンビーズに結合するのですが、目的のタンパク（６０kDaほど）をGSTと結合させると、グルタチオンビーズへの結合が1/10ぐらいになってしまいました。 大腸菌内での発現量はGSTのみとGST＋目的タンパク質でも大差はなかったのに。 アグリゲーションを起しやすいタンパク質だったため、可溶性のフラクションと言えども、GSTへの結合が抑制されるような構造になってしまったのかもと思いましたが、詳しい原因はわかりません。 みなさんのコメントを見る限りでは、こういうことはあまりないのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2011-8 - 2010/02/02 (火) 15:06:17 - 的を射る とりあえずGST抗体でウェスタンくらいはやっておきたいところですね。 たぶん大丈夫そうだけど、すっきりしないです。 私なら立体構造的に何か障害があるのかなと思ってタグを変えます。おそらく3種ともダメだから何かあると思っているのでしょうが。担体がダメになっているとかはないですよね、一応。 あとはタンパクの等電点とかがどちらかに振れているとか？

追加 削除/引用 No.2011-7 - 2010/02/02 (火) 13:12:20 - ta 質問!様に対する回答です。 １．ＧＳＴウエスタンはやっていませんが、普通のＧＳＴをコントロールとして大腸菌のライセートを流すと、ＧＳＴ−Ａ，Ｂ，ＣではＧＳＴプラスアルファのところに特異的バンドが出ます。また、プラスミドのシーケンスは構築のとおりであることを確認しています。 ２．ソニケーションは、ＰＢＳプラスデタージェントのみです。 ３．ビーズ、および溶出フラクションには、ほぼ全然！？バンドがありません。心の目で見ても、ＧＳＴのみコントロールの０．１％くらい？です。 ４．受託ウサギ免疫で、ポリクロ抗体の抗原として使う予定です。ペプチド免疫でも良いのですが、合成からコンジュゲート、免疫とやるとコスト面で抵抗があります。ペプチド免疫がうまくいくとも限りませんし。。。

ありがとうございます 削除/引用 No.2011-6 - 2010/02/02 (火) 13:01:33 - ta どのアドバイスも、的を得ていて感謝です。 ＧＳＴ自体をあきらめて、というのはもう少し後にしてもちょっと頑張ってみたいのですが、anti-GSTで精製する、というのは抗体固相化とか、elutionとかが難しいイメージがあります。すでに抗体がコンジュゲートされたビーズって売っているのでしょうか？ あくまでグルタチオンビーズでやるなら、ＴＲＩＴＯＮのみ、あるいはサルコシルを減らす、というのが正攻法なんですね。ＤＴＴを加える、というのも一般的にあるようですが、試してみようかと思っています。

(無題) 削除/引用 No.2011-5 - 2010/02/02 (火) 12:59:15 - 質問! 同様の経験は有りませんが、気になる点として（他の方と重複しますが） 1. 発現しているというタンパク質は本当にGST-A,B,Cなのか？ GST抗体でWBしてみましたか？ 2. Buffer条件はどのようなものなのか？ 単純にPBSプラスdetergentのみ？ 3. 結合しないとの事ですが、全くですか？ 10%でも結合していれば何とかなると思いますが（目的にもよりますが） 4. 最終的にはどういったassayをお考えなのか？ それ次第ではGST以外という選択肢も出てくるでしょう

(無題) 削除/引用 No.2011-4 - 2010/02/02 (火) 12:10:58 - MP サルコシルが悪さをしている可能性はないでしょうか？ Tritonのみ、あるいは濃度を下げてでやってみるのも手かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2011-3 - 2010/02/02 (火) 10:09:25 - ami anti-GST antibody beadsを試す。

(無題) 削除/引用 No.2011-2 - 2010/02/02 (火) 08:37:09 - がっくん GSTを諦める。

GST fusionがビーズに結合しない 削除/引用 No.2011-1 - 2010/02/01 (月) 20:03:46 - ta 目的タンパク（膜タンパクの細胞外領域）の３か所より、それぞれ４０アミノ酸の配列をＧＳＴに融合したタンパクＧＳＴ−Ａ，ＧＳＴ−Ｂ，ＧＳＴ−Ｃを作っています。 大腸菌でのinduceはＯＫ、可溶化もされているのですが、glutathione beadsによる精製ができません。 ビーズとincubation後に、上清、つまりフロースルーの方には目的タンパクが確認されますので、タンパクがビーズに結合していないようです。 GST onlyのコンストラクトは、同じ条件で発現、可溶化、ビーズ結合、溶出すべてＯＫです。目的タンパクはＡ，Ｂ，Ｃと３種類あるのに、一つもくっつきません。 ソニケーションバッファは、１％TRITON, 1%サルコシル入りのＰＢＳを用いており、この条件で過去にはほとんどのコンストラクトで成功しています。 可溶化で問題になることは多くあるのですが、ビーズに付かない、という経験は初めてです。何をoptimizeすればよいか、ご示唆いただければたいへん助かります。

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