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(無題) 削除/引用 No.201-9 - 2010/03/23 (火) 18:13:00 - Keisuke 　私が作った Mac 専用の IdentityX というアプリケーションで degenerate primer の設計ができます。うちのラボでは IdentityX で設計したプライマーでほとんど成功しています。 　３’末端同士、３’末端とプライマー内のアニーリングを避け、組み合わせの数の最大値を指定できます。 　私は通常の PCR の１００倍量のプライマーを使用し、 Tm も４０、５０、６０度というように３段階くらい試します。温度が高い方が良いこともしばしば有ります。 　余談ですが、学生が間違えて IdentityX で設計した degenerate primer でシークエンスをしたところ驚くほど綺麗に読めていました。 　どうぞお試し下さい。 http://home.hiroshima-u.ac.jp/kei/IdentityX/index.html

(無題) 削除/引用 No.201-7 - 2009/03/17 (火) 16:41:04 - Pumpkin PCR条件について何も記載されていないので、至極一般的な回答になりますが、 primer setは、ダイマーを形成するような配列をお互いに持っていませんか？ 増幅がうまくいかなかった時にはプライマーダイマーは出来やすいので、目的の増幅産物が得られない時には出やすいでしょう。何かしらの増幅産物ができているのにプライマーダイマーができるときは、アニーリング温度を上げてみたりとPCR条件を最適化することによって改善できる場合があります。ホットスタートやタッチダウンなどで特異性を上げるようなことをすればでなくなる可能性もあります。 またプライマーの量を少なくすると改善できる時もありますが、縮重プライマーのときは、ややプライマー量を多くしていることもしばしばですので、よくないかもしれません。 まとめると、プライマー対に問題がなければPCRの最適化によって解決できるかもしれません。ただ、100%マッチのようなPCRとは効率が違いますから、ある程度は許容していいと思いますが。もちろん、目的増幅産物が得られていれば許容できるという話です。

(無題) 削除/引用 No.201-6 - 2009/03/17 (火) 16:38:45 - こうじ 皆さんがおっしゃられているようなことに加えては やはり通常のPCR条件検討もありますね。 Mg濃度、アニーリング温度、酵素を変えてみるなど。 degenerate primerはmixが1000種類を超えないように イノシンなども入れて作れって昔言われたことがあります。 1024mixまでしか作らないので入れたことないですが。 PrimerとTemplate DNAにPCR用の水を加えただけで 一度煮て（98度で5分とか）、急冷してから PCRに使用するなどは行っているでしょうか。 あとは、template DNAは大丈夫でしょうか。 恥ずかしながらこれにやられた経験があります。 template DNAをPCRの条件検討に入れないで行っていたときには これにハマると抜けるまで時間がかかるんです。 cDNAライブラリでは幾ら条件を変えても（primerを何度か作りなおしても） つれなくてRT-PCRにしたら一発でつれたこともあります。 それからしばらくRT-PCRばかりでやっていたのですが、 RT-PCRでつれなくて、ゲノムから増やしたら一発ということもありました。

Degenerate primerの作り方 削除/引用 No.201-5 - 2009/03/17 (火) 15:39:58 - ！！！ Pumpkinさん、DSCさん 教えて頂きありがとうございます。もう一度、PumpkinさんやDSCさんがおっしゃるとおりプライマーを作ってみたいと思います。 あと、もう一つ教えて頂きたいのですが、縮重プライマーを使ってPCRをするとプライマーダイマーがでてくるのですが、プライマーダイマーがでることは避けられないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.201-4 - 2009/03/16 (月) 18:59:56 - Pumpkin DSCさんのおっしゃるとおり、確かにNested PCRは有効かもしれません。 縮重プライマーですから、私もアミノ酸配列から設計しています。ちょっと先走ったなと思ったのは、ある生物種ですでに蛋白質配列が決まっていて、それのオーソログを他の生物種で拾おうとしている、もしくはファミリーを拾おうとしていると限定してい考えてしまいました。

(無題) 削除/引用 No.201-3 - 2009/03/16 (月) 18:45:36 - DSC タンパク質のアミノ酸配列に基づいて設計する場合ですが。 本当のターゲット以外へのアニールを極力抑えるために、「縮重」とは言ってもできるだけヴァリエーションを減らせる場所で設計すべきと思います。 ・できる限り「Leu, Ser, Arg」（6つのコドンが対応するアミノ酸）を含まない配列部位。 ・できれば「Pro, Thr, Val, Ala, Gly 」を含まないかそれらが少ない部位。 ・できれば「Trp, Met」を含む部位。 以上３点を目安に設計する領域を探せば、自動的に配列のヴァリエーションは少なくなりますよね。 私もpumpkinさんのように、およそ30-35merくらいで設計するのがよいと思います。Tmの計算は適用できないと思ってよいので（ヴァリエーションの中で実際にどれがアニールするかわからないし、標的と完璧に同じ配列でなくても働くから）、普通のPCRと比べると「ちょっと長すぎるかな」くらいでもOKだと思います。 同じく、センス・アンチセンスともに２つずつは設計してよいかと思います。Pumpkinさんが書かれているように複数の組合わせを試すことができるというのもありますが、複数のプライマー対があれば、Nested PCRを行なうこともできます。私が行なった縮重プライマーでのPCRでは、Nestedをやって初めてはっきりした増幅産物が得られたことが多いです。 あと、私は3'末端が縮重塩基にならないようにしています（もちろんその部位のアミノ酸配列が確実に間違いないとき）。それが効いて増えているのかはわかりませんが。

(無題) 削除/引用 No.201-2 - 2009/03/16 (月) 17:52:38 - Pumpkin 縮重プライマーを作るときに一番大事なのはファミリーまたは異生物間であっても高度に保存されている領域が推定されることが大事ですが、そのような領域でプライマーを設計されていますか？ 3'側のミスマッチを極力減らせるようにして30塩基対くらいの長めのプライマーを設計するように心がけています。どうしてもミスマッチが多くなるのは仕方ないので、アニーリング温度を下げて、目的産物の長さがあるPCR断片を得ようとします。40℃でうまくいった経験があります。 縮重プライマーはいくつものプライマーセットを、少しづつずらしたりしながら作ると思いますが、それなりの数は試されたのでしょうか。例えば、foward３つ、reverse３つプライマーを作れば全部で９通りのプライマーセットができるので、どれかで走る可能性が出てきます。

Degenerate primerの作り方 削除/引用 No.201-1 - 2009/03/16 (月) 17:33:49 - ！！！ いつも、勉強させてもらっています。 最近、Degenerate PCR（クローニングのために）をしています．本で勉強してDegenerate primerを作製しDegenerate PCRを行っていますが、全く目的のサイズのバンドが引っかかってきません。Degenerate primerの作り方が悪いのだと思います。もし、知ってらっしゃる方がいれば教えて頂きたいのですが、Degenerate primerの作成方法で気をつける事や良い参考書があれば教えて頂けないでしょうか？また、皆さんの作成方法も教えて頂ければ嬉しいです。

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