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(無題) 削除/引用 No.2003-8 - 2010/02/02 (火) 00:16:52 - Tb >[Re:4] CJさんは書きました : > 興味深いですね。私はFACSはやりませんが、組織の場合は固定後蛍光は保持されています。ただ、前述したように蛍光が弱くなるという話はあるので、検討の必要はあると思っています。 そうすると、単純にできる・できないの一言ではかたづけられないtipみたいなのがありそうですね。考えられる点としては 1) 細胞蛍光免疫染色法だと固定は室温20分とかしっかりコントロールされているが、FACSで固定というと染色終了から解析までの保存を目的としているのでたいていは20分以上の長時間になってしまうという固定時間の差。 2) FACSでのdead cell excusionを目的としたPI染色は1 ug/mlくらいでするが、もしかすると蛍光が低下するすることを加味してもっと高濃度で入れればいいのかもしれない。 ・・・と思ったのですが、CJさんのご紹介論文は0.5 ug/mlでPI染色して、そのあと室温20 hr固定のようですので、これでは説明できないですね。。。 FACSではPI染色後の固定はできない（あるいはしないほうがいい）のサポート情報としては、http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/filelibrary/cell_tissue_analysis/pdfs.Par.5425.File.dat/B-084632-Live-Dead-FHR-1.pdf の中の解説、「Nucleic acid–binding dyes like propidium iodide (PI) are not as effective as dead-cell stains in these types of assays (=染色後の固定のこと) because they leach out of dead cells with washing. Also, all cells stain with PI once they are aldehyde fixed.」を一応あげておきます。 ほかの方の経験談などありましたらよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2003-6 - 2010/02/01 (月) 09:54:29 - CJ windowさん 固定後ＰＩ染色と固定前ＰＩは意味が異なります。 前者は核染色ないしＲＮＡ染色であり、後者は死細胞染色です。今話題になっているのは固定前組織で染色したＰＩが固定によって弱くなるのではないか、という話です。

(無題) 削除/引用 No.2003-5 - 2010/02/01 (月) 09:43:05 - window FACSで細胞周期を解析しておりましたが、 ７０％エタノールで固定後、PI染色しておりました。 固定でPI染色が悪くなるとは思いませんでした。 PI染色してから固定はしたことはありません。

(無題) 削除/引用 No.2003-4 - 2010/02/01 (月) 08:54:26 - CJ 興味深いですね。私はFACSはやりませんが、組織の場合は固定後蛍光は保持されています。ただ、前述したように蛍光が弱くなるという話はあるので、検討の必要はあると思っています。 以下の論文がスライスでのＰＩ死細胞染色の例です。 The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Tanaka Y, Tanaka Y, Furuta T, Yanagawa Y, Kaneko T. J Neurosci Methods. 2008 Jun 15;171(1):118-25. Epub 2008 Mar 13.PMID: 18430473

(無題) 削除/引用 No.2003-3 - 2010/01/30 (土) 23:28:52 - Tb (sakuraさん）>固定前にPIをwash outすれば良いと思っています， (CJさん）> おっしゃる方法でＯＫです そうなんですか？蛍光顕微鏡でのぞいたことはないのですが、FACSではPI染色後にPFA固定すると、PIの蛍光はまったくなくなるので、だめなのですが・・・

(無題) 削除/引用 No.2003-2 - 2010/01/30 (土) 14:43:41 - CJ おっしゃる方法でＯＫです。 ただ、ＰＩが固定後徐々に流れ出るといううわさがあるので、早めに観察するほうが良いかもしれません。

ヨウ化プロピジウム 削除/引用 No.2003-1 - 2010/01/30 (土) 06:33:21 - sakura 固着細胞の中の死細胞をヨウ化プロピジウム（PI)で細胞死亡率をみようとしています． 蛍光顕微鏡でカウントしようしているのですが，ヨウ化プロピジウムで染色後，パラホルムアルデヒド等で固定できるのでしょうか．プロトコール上は固定前に写真をとるように書いてあります．たくさん写真をとらないといけないので，時間がかかるので，固定したいと思ってます．固定すると細胞膜が破壊され，PIが細胞内に入ると思うのですが，固定前にPIをwash outすれば良いと思っています， よろしくお願いします．

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