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(無題) 削除/引用 No.1996-5 - 2010/01/29 (金) 10:32:44 - Tori 有難うございます。普通のTaqでも大丈夫との事で、やってみます。

(無題) 削除/引用 No.1996-4 - 2010/01/29 (金) 09:35:48 - みみ PCR産物をアガロースゲルで流して，切り出してからシークエンスすれば普通は読めます。しょっちゅうやっています。100 bpだとちょっと短いですが，両側から読めば行けると思います。 Templateの量が多すぎると読めないことがあるので注意した方がよろしいかと。プラスミドを読む時よりかなり少ない量です（細かい濃度はシークエンスキットの説明書に書いてあると思います）。 PCRの酵素はなんでも大丈夫です。いくらfidelityが低い酵素でも，特定の塩基で言えば変異が入る確率は1/1000以下なので，シークエンスのシグナルに影響を及ぼすことはありません。私はいつもTaqで増やしたものを読んでいます。

(無題) 削除/引用 No.1996-3 - 2010/01/29 (金) 09:05:37 - Tori お返事有難うございます。そうです。クローニングを普段行っていないので、できれば直接シークエンスしたいと考えていますが、High Fidelity Taqなどを使えば少しは旨くいく可能性が高まるものでしょうか。最後の手段としてもしクローニングするのなら、より長い配列を使いたいと思いますが、PCR自体がうまく行かない場合、RACEなどを使うしか方法がないでしょうか。種間の塩基配列が相当離れているようで、苦労しております。よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1996-2 - 2010/01/29 (金) 07:42:15 - ~ そのままでは他の増幅産物のシグナルも拾うため、読めない場合が多いと思います。 バンドを切り出して、Tベクターに入れてから読めば問題は生じないと思いますが、 それでは手間がかかりすぎるということでしょうか？

PCR産物からのシークエンシング 削除/引用 No.1996-1 - 2010/01/29 (金) 03:36:35 - Tori ゲノム解析がまだ全くない種において、一番近いと思われる鶏の配列を使ってプライマーデザイン、ｑPCRを行っています。ある遺伝子に限って、なかなかうまくいかず、やっと通常のTaqを使ったPCRでは100 bpほどのバンドが見られるようになってきたのですが、ｑPCRに移行するとCtが高すぎて使い物になりなりそうもありません。そこで、PCR産物を直接シークエンスして、より適切なプライマーを作れないかと考えているのですが、Taqを使ったPCR産物でシークエンスが成功するものでしょうか。経験あるから、ご教授おねがいします。その他、アドバイスも大歓迎です。

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