毎度参考にさせてもらってます。現在免疫細胞染色の実験をしているものですが、最近検出時の非特異蛍光に悩まされています。
処理の流れとしては4%パラホルムアルデヒドで30分間室温、その後膜透過処理として0.1% tritonで10分間の処理をしています。ブロッキングは5%血清を含むPBS(−)で30分間行なっています。
抗体反応は一次抗体が市販のmonoclonal抗体 in mouseと免疫したウサギより精製したpolyclonal抗体を使用しています。それぞれに対する二次抗体はAlexa488 anti-mouse IgG1 in goatとAlexa594 anti-rabbit IgG in donkeyを使用しています。
染色結果としては各々単品で染色した際はキレイな染色が得られています。しかし二重染色を試したところ、非特異と思われるゴミのようなものが無数に見られました。
今回の場合は同じ哺乳類のホストというだけでなく抗体のサブクラスがIgG1とIgG全般のもののために生じたものではないかと考えています。そこでこういった非特異をなくすために何か染色方法を代えることで改善できないでしょうか。いま考えているのは片方の一次抗体、二次抗体を用いて抗体反応までを済ませてからブロッキングまで戻り、再び２種類目の抗体で反応させようと考えています。このような方法は一般的なのでしょうか。何分知識がないのでご理解のある方がいらしたらご教授お願いします。 |
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