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(無題) 削除/引用 No.1988-8 - 2010/01/30 (土) 16:48:25 - sami うさん ご指摘ありがとうございます。 おっしゃられることはごもっともです。あくまでタンパク質の発現を見ているだけなので，そのトリガーは何なのか，という事を厳密に突き詰めていく必要があると思います。 特に個体を扱っているので，雑刺激を出来るだけ減らして刺激を単一に近づけていく工夫が必要になってくるのだと言う事が，実際に自らの手でやってみて痛感しました。 また，電気生理学的なデータやKO, virusなどの分子生物学的手法と照らし合わせることも必要不可欠なのですが，そこのターゲットを絞るという意味でも意義はあるのかなと感じております。 まだまだ認識は甘いのかもしれませんが。。。。 CJさん そうですね，やはり同一の切片で見れた方が良いですね。 ですが，残念ながらもう私はタイムリミットなので，次の方や他のラボメンバーに残していけるように残された時間努力します。 初学者の理解不足にも関わらず，対応していただき本当にありがとうございました。 不足している部分は多々ありますが，何とか1つのデータとしてまとめたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1988-7 - 2010/01/30 (土) 14:42:32 - CJ うさんの言うことはもっともですが、卒業研究では多角的な実験は時間的な制約で難しいかもしれません（あとでＰＩがいろんな実験をまとめて論文にするのではないでしょうか）。 samiさん クレシル紫は対比染色でも良いですし、隣の切片でもかまいません。 対比染色のほうが神経核の同定が楽でよいですね。ただし、薄く染めないとＤＡＢの反応が見えにくくなってしまいますのでご注意。

(無題) 削除/引用 No.1988-6 - 2010/01/30 (土) 10:40:46 - う 私はそもそも、何か１つの実験結果だけでものを言うのが怖い派なので、 質問者様のように、免疫染色でポジティブな細胞が多い少ないをいうことに どこまでことの本質を自分がとらえているのか？ さんざん免疫染色してカウントして印象を見ていっても疑うので、 他の実験で増加しているということを示す結果が添えることが出来たとき 合わせ技で自分も納得、正確性もアップとちょっと安心します。 ここでいうなら（詳しい状況はあまりわかりませんが） ウエスタンなりPCRなりで増加が見られるという結果を添えますけどね。

(無題) 削除/引用 No.1988-5 - 2010/01/29 (金) 22:58:39 - sami お返事ありがとうございます。 遅くなってしまい申し訳ありません。 > ＤＡＢ染色をしているんなら、クレシル紫で染色はできないんですか？写真を撮るにも説得力が出ると思うんですが。 クレシルバイオレットで染色するのは，DABで染色した切片に対してでしょうか？それとも，切片を作成する際にクレシルバイオレット用に一枚取っておくのでしょうか？ 何度も申し訳ありません。 組織染色に対して精通している方が近くにいないもので。。。

(無題) 削除/引用 No.1988-4 - 2010/01/28 (木) 13:30:02 - CJ 楕円で定義する、ってのがいかにもまずいですね。神経核はいろいろな形をしていますから。通常の実験ねずみを使っていれば神経核の位置はかなり安定して一致するはずですが、そうであっても必ず対比染色を利用して神経核を定義するのが流儀です（染色時に収縮が起こったりするので、位置がアトラス通りになるとは限らないので）。 ＤＡＢ染色をしているんなら、クレシル紫で染色はできないんですか？写真を撮るにも説得力が出ると思うんですが。

(無題) 削除/引用 No.1988-3 - 2010/01/28 (木) 12:51:15 - sami CJさん ご返信ありがとうございます。 > 客観性がないとはひどい物言いですね。 客観性が無いという趣旨ではなかったのですが，誤解させるような言い方をしてしまい申し訳ありません。 例えば，bregmaから同じ位置の切片を切り出してきたとして，その切片内のある部分を基準として何度の角度で何mm先から，何度の角度で何mm先までを楕円で描き，その範囲で細胞数をカウントする。という事をやろうと思ったのですが，基準となる部位に個体差があり，なかなか上手くいきませんでした。 ですので，こういった手段で客観性を持たせることが果たして正しいのか疑問に思い質問させていただきました。 > 神経核は古典的にはニッスル染色、ゴルジ染色で定義されますし、より新しい方法ではマーカーを利用する手があります。トレーサーを使うのもありでしょう。 > 簡単にやりたいなら、ニッスル染色で対比染色をして、神経核の境界を定めてください。ただし訓練が必要でしょう。 > 訓練が少なくて済みそうなのは、ご興味の神経核の発現マーカーで免疫染色なりin situ hybridizationなりをおこなって神経核を定めることです。 なるほど，マージさせて定義すれば良いのですね。 ですが，今からやるとなると現実的ではないかもしれません。。。 > 細胞数についてですが、これは切片の厚さや計測部位の面積に依存しますし、統計処理をしたければランダムサンプリングに従った計測法が必要になります。それを行ったらお望みの客観性というやつがゲットできるでしょう。stereology.infoなども参考にしてください。 stereology.info 参考にさせていただきます。 最終的には単位面積当たりの陽性細胞数を算出して比較しようと考えています。

(無題) 削除/引用 No.1988-2 - 2010/01/28 (木) 12:22:16 - CJ たぶんc-fos陽性細胞を数える、とかそういった類のものでしょうが、客観性がないとはひどい物言いですね。 神経核は古典的にはニッスル染色、ゴルジ染色で定義されますし、より新しい方法ではマーカーを利用する手があります。トレーサーを使うのもありでしょう。 簡単にやりたいなら、ニッスル染色で対比染色をして、神経核の境界を定めてください。ただし訓練が必要でしょう。 訓練が少なくて済みそうなのは、ご興味の神経核の発現マーカーで免疫染色なりin situ hybridizationなりをおこなって神経核を定めることです。 細胞数についてですが、これは切片の厚さや計測部位の面積に依存しますし、統計処理をしたければランダムサンプリングに従った計測法が必要になります。それを行ったらお望みの客観性というやつがゲットできるでしょう。stereology.infoなども参考にしてください。

免疫染色での細胞数のカウント 削除/引用 No.1988-1 - 2010/01/28 (木) 12:07:41 - sami みなさま始めまして。 今卒業論文の為に免疫染色のデータのを解析しているものです。 1つ壁に当たっていて，お尋ねしたいことがあります。 マウスの個体を刺激し，神経核でのあるタンパク質の発現細胞数をDAB染色し，カウントしたいのですが，神経核をどのように定義すればよいのか悩んでいます。 論文などを読んでみても，画像解析ソフトを用いてカウントした，などの記述しかなく，困っております。 ボスからは，客観性と再現性を求められており，写真を見せてもどうやって写真を撮ったのか（つまりなぜこの視野の写真を選んだのか），細胞数を数えるときもどこからどこまでの範囲を区切ったのか，などと言われてしまい，途方にくれてしまっています。 確かに，範囲を区切る区切り方が人によってずれれば結果が変わってしまうのは理解していますが，どこまで追求すればよいのでしょうか？ 目視ではコントロールと有意差がありそうなのは見えるのですが，私の目には見える，では当然ダメなのも分かっております。 そもそもこういった組織のデータに定量性を客観的に定義することはナンセンスなのではないかと感じています。 アトラスなどを読んでも，キレイな円で神経核を定めており，また本によっても位置などが微妙にずれており，一般的な定義づけはされているのでしょうか？ 使用しているソフトはimageJで，神経核全体が含まれているであろう10倍の写真全体にガウシアンフィルターをかけ，元画像との差分を取り，閾値を設定して陽性細胞を浮かび上がらせています。 ここまでは問題ないのですが，その先にアドバイスを頂ければと思い投稿させて頂きます。 取りとめもなく書いてしまいましたが，些細なことでも構いませんのでよろしくお願いいたします。

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