全19件 ( 1 〜 19 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1983-19 - 2010/01/30 (土) 01:10:48 - m ＞ｐ８５はIP上清には全く検出されず、Total lysate, IPにはしっかり検出されています。 IP上清には全く検出されないというのに、ちょっと違和感があり屁理屈をこねます。 Total lysateにばっちりあるくらいの量がIPで完全に検出されなくなるほど回収できるかなぁと思ってしまって（抗体の量にもよるかもしれませんけど）。 そもそも、本当にｐ８５のIPがうまくいっているのですよね？たまにビーズそのものに何かしらのタンパク質が付いていてそれを非特異にみてしまうことがあったので。 ＞よく見ると、EGFRの検出をしたメンブレンでも同様に２５０ｋＤａ以上の部分に強くバンドがみられているので 単に、ｐ８５と思って見ているものも（Total lysate, IPともに）は非特異 EGFRとERBB3の２５０ｋＤａ以上の部分に強くバンドも非特異（この二つは同じ動物種の抗体だったりして） こんな感じになってしまっているとか・・・。 ビーズだけ、もしくはノーマルの抗体をつけたビーズで同じような作業したことありませんか？ 戯れ言に近いことですが・・・。

(無題) 削除/引用 No.1983-18 - 2010/01/30 (土) 00:57:13 - USB 免沈様 　酸でのelutionは50〜100mMGlycine-HCl pH2.5〜3.5で大丈夫です（クエン酸塩溶液を使用される場合もあります）。溶出後、1/10 volumの1〜2M Tris-HCl pH8.5〜9.0かなんかを加えて中和する必要があります。 　塩でのelution（塩基ではありません）は200mM〜１Mぐらいの塩で行います。 　ググれば詳しい組成は出てくると思いますし、IPの方法が載っているような本ならどっちは書いてあると思います。 　なお、ビーズと抗体をクロスリンクしていない場合は抗体も溶出されます。逆にクロスリンクしていれば抗体が理論上、落ちてこないので抗体が邪魔な場合は時々使います。

(無題) 削除/引用 No.1983-17 - 2010/01/30 (土) 00:53:35 - モモ 免沈さま、私の書き方がまずくてかえって誤解をさせてしまったようなので補足させてください。 蛋白のアグりは実験のどのステップでも起こりうることで、必ずしも抗体とインキュベートしたときに起こるわけではないです。蛋白自身の性質で、アグりやすさが決まるように思いますが、蛋白の濃度や、バーファーによっても影響を受けます。一般には４℃より室温の方が短時間で起こるし、室温より１００℃の方が短時間で起こると思います。しかし、蛋白によっては４℃でも数十分おいていただけでアグってしまうことも経験しましたし、ボルテックスしただけでアグることもあるようです。

(無題) 削除/引用 No.1983-16 - 2010/01/30 (土) 00:50:14 - ； マスって言うのは簡単ですが、そんな簡単にできませんよ。ちゃんと立ち上がったところでないと、ケラチンだらけでどつぼです。免疫沈降で見えるバンド以上のタンパク質はそこに存在するのです。マスする研究室は、それはもう実験機材を綺麗にしてますし、他の人が触るのを嫌うくらいです。それより、同じような因子を扱っている人を見つけてみたりして話を聞いてみたり、単に免疫沈降しているところに話を聞いた方が建設的だと思うなぁ。

(無題) 削除/引用 No.1983-15 - 2010/01/30 (土) 00:38:53 - c さっきマスと略したものはLC-MS/MSと呼ばれているものです。私も専門外ですが、クロマトグラフィーとマススペクトロメトリーが連動したようなものです。ゲルを切り出してトリプシンなどでゲル内で蛋白質を短いペプチドに分解してから抽出して、それらのペプチド断片をLC-MS/MSにかけてペプチドのアミノ酸配列を分析します。微量だったり未精製のクルードなサンプルでもそに存在する蛋白質の同定が可能です。外注すると高額ですが、最近はいろいろな大学や研究機関に普及しつつあるようなので、ルーチンで動かしてるところもあると思うし、共同研究のような形で頼めばやってくれるところはあると思います。あと私もLC-MS/MSの機器の操作は自分ではやったことないですが別に恥ずかしい事でもなんでもないと思ってます。

(無題) 削除/引用 No.1983-14 - 2010/01/29 (金) 23:42:58 - 免沈 みなさまお世話になっております。 先ほど、前回までと同じ条件で現像が終了しました。 やはり初めに質問した際と同様の２５０ｋDa以上のところに濃いバンド、本来のERBB3（１８５ｋDa）のところに薄いバンドが検出されました。 やはりｐ８５はIP上清には全く検出されず、Total lysate, IPにはしっかり検出されています。 ということで再現性を持ってバンドが出ているようです。 自分なりにこの情報のバンドがアグッた蛋白によるものなのか全くのノンスペなのかはっきりさせないと本来の目的に進めないところです。 前回のtotal EGFRでも同様の２５０ｋDaオーバーのバンドが出ているので、ちょっと考えてみたのですが、今回のサンプルたちは癌細胞からの抽出産物なのですが、同時にEGFR阻害薬を曝露させたものも抽出して一緒に流しています。 そこで、pEGFRを検出してみて、上記の２５０ｋDaの部分の両者の違いをみてみればそこの部分にEGFRが含まれているかどうかがわかるかな、と考えてみたのですがどうでしょうか？ そもそもアグッた状態でもpEGFRが検出できるのかわかりませんが・・・。 モモさんがおっしゃっていることですが 「１次抗体とのインキュベートをO/Nですると、どうしてもアグる蛋白が出てきますので、１−２時間がおすすめです。どうしてもO/Nが必要なときは、アグった蛋白をサンプルに持ち込まないようにゆるい条件で溶出する方法もあります。」 自分的に用語の間違いをしていたようで申し訳ありませんが、「アグる」というのは抗体とのインキュベート時に起こることなんですね^^;勝手にboilでbeadsから剥がすときの加熱によって凝集してしまうことなのかと思って使っていました。 cさんが言われるように、切り出してマス（クロマトグラフィーのことですよね？）にかけてみる、というのが有効かもしれませんが、恥ずかしながら自分のラボに自分も含めて出来る人がいません。可能であればやってみたいです。 USBさんありがとうございます。 酸か塩基で溶出というのも恥ずかしながら方法がわかりません。。。また調べてみようと思います。 自分としてはようやく形がみえてきそうなIPをなんとかラボに復活させたいと思って頑張ってますが、おかげでメインの実験がすすみません＾＾； でももう少し頑張ってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1983-13 - 2010/01/29 (金) 09:39:57 - う ユビキチン化だったりして。

(無題) 削除/引用 No.1983-12 - 2010/01/29 (金) 02:13:08 - USB 免沈様 ＞スタッキングゲルからランニングゲルに入ってちょっと進んだくらいの所に現れています。 　というふうな表現から私はアグってることを疑いました。幸いにも私は今までにアグるようなタンパク質を扱ったことがないので、良い対処法を存じ上げません。ですが、私であればまずビーズにサンプルバッファーを直接加えてelutionするのではなく、酸か塩でelutionしてみようかなと考えます（すでに試されているかもしれませんが…）。 　お役に立てずすみません。

(無題) 削除/引用 No.1983-11 - 2010/01/29 (金) 01:02:09 - モモ サンプルの還元が不十分な可能性と対処についてはｃさんが書かれていらっしゃいますし、手持ちのサンプルで確かめられますので、まずはそちらを試されるのが良いと思います。 それとは別に、私はIP中の蛋白のアグりの可能性を指摘しておきます。 ビーズを使ったプレクリアリングには、アグりやすい蛋白をある程度取り除く意味もあると思います。 １次抗体とのインキュベートをO/Nですると、どうしてもアグる蛋白が出てきますので、１−２時間がおすすめです。どうしてもO/Nが必要なときは、アグった蛋白をサンプルに持ち込まないようにゆるい条件で溶出する方法もあります。

(無題) 削除/引用 No.1983-10 - 2010/01/28 (木) 19:12:24 - c IgGのS-Sはけっこう切れにくいので、還元剤が古かったり、加熱が不十分だと中途半端な切れ残りが出来て、高分子量領域に変なバンドとかが複数出たりする(80KDaくらいとか150KDaくらいとかゲルトップの辺。スメアっぽいというかラダーっぽく見えるときもある）。IgG由来かどうかはブロッティングして２次抗体だけでそのバンドを検出出来るかどうか調べればわかる。またバンドがクマシーで染まるくらいあるなら、切り出してトリプシン消化してマスにかけてみれば正体が分かると思う。というか分子量がかなりズレているとすると、同定しないとみな可能性の域を出ないし。

(無題) 削除/引用 No.1983-9 - 2010/01/28 (木) 18:03:24 - う 100℃より低い温度で長時間というものあるが、 IPということなので、 以前、低い温度でやったとき、 IPに使用した抗体がきちんと変性してない、 という経験と 温度を上げたり時間を延ばして逆効果になるほど 100℃で５分で処理という条件において既にアグるタンパク質なのか？ という疑問（主観でそんなことないだろうと） これらのことから、 前のことを申したまで。 既にやっているのなら、その結果に勝るものはありません。

(無題) 削除/引用 No.1983-8 - 2010/01/28 (木) 17:41:46 - 中年 アグってるのが原因だとしたら、温度を上げたり時間を延ばしたりは逆効果です。37℃ 30分間を試してごらんになっては？

(無題) 削除/引用 No.1983-7 - 2010/01/28 (木) 17:37:22 - 免沈 うさん、ＵＳＢさんありがとうございます。 たしかに同僚からも同じようなことを言われたものでもっと長くboilしてみることや70℃で10分程度（他のスレッドでそういう設定の話があったと思いますが）とかも試してみたらいいのかなと思っています。 まさに今現在も同じ条件での泳動真っ最中なのですが、これでやはり同様のバンドが出るようなら条件を長くしてみようと思っています。 ただ、あまり長く煮ると蛋白が変性？してしまうのかなとか思ってしまうのですが、いかがでしょうか？それとももともとＳＤＳを加えての変性条件なので問題ないのでしょうか？ 中年さんありがとうございます。 　おっしゃるようにもちろんリン酸化による修飾が関係しているのかもしれませんが、その差が１００ｋＤａ程度も違いそうなのでちょっと考えにくいかと・・・。 　よく見ると、EGFRの検出をしたメンブレンでも同様に２５０ｋＤａ以上の部分に強くバンドがみられているのでやはりみなさんがおっしゃるようにアグッている可能性があるのかもしれません。 　もしアグリが原因の場合はどのように回避しておられますか？引き続きお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1983-6 - 2010/01/28 (木) 15:01:36 - USB アグってるに一票

(無題) 削除/引用 No.1983-5 - 2010/01/28 (木) 14:33:55 - 中年 p85とErbB3の結合はErbB3側のリン酸化に依存しているでしょうから、total lysateの方は非リン酸化型メイン、IPの方はリン酸化型メインのバンドが見えてるんじゃないでしょうか。 ただ、それにしてはシフトが大きすぎる気もしますが。

(無題) 削除/引用 No.1983-4 - 2010/01/28 (木) 14:21:12 - う boilが100℃ということから、もしかして 鍋とかで煮ているのでなくてインキュベーターか？と想像したりしたのですが、 そうでなくても、一度、鍋で１０分以上煮てみたりしてはいかが、かと。 そのようなバンドは、スタッキングゲルからランニングゲルに移る時、 アグっているに近いというか感じ（うまくいえない）タンパク質が 泳動されづらくなっているときに、生じていた気が私はします。

(無題) 削除/引用 No.1983-3 - 2010/01/28 (木) 13:49:44 - 免沈 モモさんありがとうございます。 IgGのheavy chainはたしか５０ｋDaくらいかと思っているのですが、検出しようとしているERBB3（HER3）は１８５ｋDaのものです。 そして少し上にでる濃いバンドというのはうちのラボで使用しているラダーが２５０ｋDaまでのものなのですが、それよりもさらに上方、スタッキングゲルからランニングゲルに入ってちょっと進んだくらいの所に現れています。（本来の１８５ｋDaのところにも少し長めに露光するとバンドがみられるのでIP自体はようやくできているのかと思っていますが。） p85（PI3K）はモモさんが言われるようにtotal lysateよりもわずかにずれた程度でバンドがでているので、これくらいならと思うのですが・・・。

(無題) 削除/引用 No.1983-2 - 2010/01/28 (木) 02:59:37 - モモ まさかとは思いますが、IPのサンプルでERbB3の少し上に見られる濃いバンドってHeavy Chain という落ちではないですよね？ 一般にはIPとライセットで同じ蛋白は同じところに流れますが、 サンプルの作り方の違いにより塩濃度やグリセロール濃度、あういは他の蛋白などが影響して、少しだけ違う位置に流れるということは良くあると思います。 あるいは、IPでは何か修飾を受けた蛋白だけ捕まえるとか、特殊なケースも考えられないことはないですが・・・

免疫沈降時のバンドの位置について 削除/引用 No.1983-1 - 2010/01/27 (水) 22:58:43 - 免沈 すみません。質問させてください。 現在、免疫沈降をやっています。 ウェスタンは大分回数を重ねていますが、免疫沈降は出来る人が外に出てしまって（その人もあまりくわしいとは言えないようですが）新たにやり始めて試行錯誤を繰りかえしています。 質問というのは、Total lysateとIP抽出液を同時に泳動して同じ高さにバンドが検出されるものと思ってやっているのですが、それでよろしいのでしょうか？ というのも、現在p85で落としてERBB3やEGFRを検出するということをやっていますが、p85はtotal lysateと同じ高さにバンドが検出されるものの（SDS-PAGEです。）、ERBB3についてはtotal lysateと同じ高さにうっすら検出されるバンドはあるんですがそれよりも大分上に比較的濃いバンドが同時に検出されてしまいます。この上側のバンドはtotal lysateの方には検出されません。 IPの最後のboilは100℃ 5分でやっていますが、それでもp85や他の蛋白とERBB3の結合が外れずに高い位置にバンドが検出されている可能性などはあるのでしょうか？ （ＩＰ後の上清ではp85はバンドが検出されないので回収効率は良いのかなと思ってはいるのですが・・・） 初歩的なことかもしれませんが、幾つかＩＰをfigureにしている論文をあたってみても、IPのバンドとtotal lysateのバンドを並べているものや大きさを書き添えているものが見つけられずに困っています。

全19件 ( 1 〜 19 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---