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(無題) 削除/引用 No.1979-14 - 2010/02/05 (金) 12:51:47 - ザンギ 配列が判ってるものしか対象にしないんなら、マルチプレックスPCRのほうが いいんじゃないかと思います。 配列未知の株も検出したいってことでしょうかね。 Tmの違うプライマーだと、配列によって検出感度が違ってきそうな気がします。

(無題) 削除/引用 No.1979-13 - 2010/02/05 (金) 09:51:32 - Mario おっしゃっていることは、ごもっともなんですが、理由としては特異プライマーで個々の遺伝子を検出するよりも縮重プライマーでどれかタイプを拾える方が安価にPCR出来るからです。 現在ある病原の検出を目指しており、ルーティンに落とした時にコストをかけずにPCRするため、現在この縮重プライマーの有効性を確かめたいと思っておりました。

(無題) 削除/引用 No.1979-12 - 2010/02/05 (金) 09:38:52 - みみ PCR産物はベクターにクローニングしましたか？ 縮重プライマーでPCRした時，幾つかの異なる遺伝子が同じサイズで増えてくる（バンドが一本に見える）ことが結構ありました。私の場合とりあえずプラスミドに入れた後で，10クローン位を数種類の制限酵素で切ってました。異なる切れ方をするものがあれば，それもシークエンスするべきです。目的分子が10本中1本で，残りはナゾの遺伝子だったこともあります。 というか特異的なプライマーがあるのに，なんで縮重プライマーを使う必要があるんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1979-11 - 2010/02/05 (金) 08:49:45 - Mario 取ろうとしているのはホモログです。 また遺伝子特異プライマーはすでにあり、こちらでも試験をしています。 できたら、同時に検出したいと思い、degenerate primerを使えたらと思っていました。 やはりシークエンスが良いのですね。教官に相談してみようと思います。サザンについても教えていただいてありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1979-10 - 2010/02/04 (木) 20:48:53 - Pumpkin まずは、増幅産物が得られて良かったですね。 ところで、この縮重プライマーは異種間のオルソログを取ろうとしているのか、同じような蛋白のホモログを取ろうとしているのでしょうか。 というのは、 >論文掲載通りの目的のバンドサイズ が「？」だからです。論文に掲載されている遺伝子をクローニングしたいのであれば、当然公開されているであろうその配列から遺伝子特異的プライマーで釣ればいいですよね？ということは、ホモログを釣りたいと言うことだと思いますが、その中でよく保存されている領域をPCRで増やしてサザンをやると言うのがいいと思います。ただ、生物種が違う場合はそのRNAもしくはDNAを入手することが難しいこともあると思います。そういう場合はシークエンスするしかないでしょう。同種の中でホモログをとる場合にはいけますが、ファミリーが多い場合には目的のものかどうかはわかりません。やはりシークエンスするしかなないでしょう。 ホモログ取りの場合は、中年さんの仰る制限酵素による消化は確認には使えないと思います。また、nestedの案ですが、これも縮重プライマーでしか作れないのであれば、大変だと思います。 いづれにせよ、サザンくらいしか方法はないように思えますし、縮重PCRの宿命なので、「さっさとシークエンス」するべきだと思います。

(無題) 削除/引用 No.1979-9 - 2010/02/04 (木) 14:08:19 - 中年 PCR産物にサイトがあるはずの制限酵素で切ってみて、予想通りのサイズに切れれるかどうかを確認してみてはどうですか。 また、どの程度と言われても困る、というより、他での経験があまり参考になるとは思われません。

その後。。。 削除/引用 No.1979-8 - 2010/02/04 (木) 13:35:13 - Mario いつもお世話になっております。 その後の結果が出ましたのでご報告と新たな疑問がわいてきたのでこちらに関しても質問させてください。 まず、先日のdegenerate PCRはアニーリング温度を調整してPCRした結果、論文掲載通りの目的のバンドサイズを得ることができました。 ここまではいいのですが、これが本当に目的の遺伝子領域の塩基配列を増幅しているのか？という疑問がわいてきました。 以前、別の試料・プライマーで今回と同じようなdegenerate PCRした経験があります。こちらも問題なく目的のサイズにバンドを得られたのですが、シークエンスを行い、相同性検索を行った結果、目的のものとは全く違う（ゼブラフィッシュ云々と書いてありました）塩基配列を増幅していたことが分かりました。 degenerate primerですし、何となく予想はしていたのですが、今回の試験でもこのような結果が起きているのではないかと懸念しております。さっさとシークエンスしてみればいいのですが、今のラボは簡単にシークエンスをできる環境ではないんです。。 ということで、目的のサイズにバンドを得られてもdegenerate PCRの場合、無関係な遺伝子もしくは遺伝子関領域を増幅してしまっている可能性はどの程度あるのでしょうか。どの程度と言われても困ると思うんですが、これに関連したご経験を教えていただいても結構です。 またこのような間違った？？増幅を回避する方法は、内側にnested primerを設計するのが一般的なやり方でしょうか。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.1979-7 - 2010/01/27 (水) 17:06:36 - ザンギ 中年さんの指摘されているように考えていたので、よく考えないで（苦笑） グラジエントサイクラーを使ってました。 FとRでTmがミスマッチする場合には上手くいかないかもしれないけど、 たいてい複数のプライマー同士の組み合わせでやるので、どれか当たるかな って 感じで実験を組んでました。 縮重プライマーの実験目的からすると、「捕れればOK」だと思うので。

(無題) 削除/引用 No.1979-6 - 2010/01/27 (水) 14:52:52 - 中年 縮重プライマーのTmの選択に関して厄介なことの一つは、仮に含まれる配列の一つが100%マッチであることを仮定したとしても、GCとATとでTmへの寄与の大きさが違うということです。下手をすると可能な配列の内、もっともATリッチな配列が100%マッチだったとしても、ミスマッチを含むGCリッチな配列の方がTmが高かったりすることもあり得ますよね。 昔、縮重プローブを使ったハイブリで関連遺伝子をクローニングしていた時に、tetramethylammonium chlorideを高濃度に含むバッファー中だとGCとATのTmが揃うので、配列によるTmの差を考えなくても、プローブの長さ（とミスマッチの場所と数）だけで決まるようになるというトリックがあったのですが、同様の目的に使えてPCRを阻害しないような試薬は無いのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1979-5 - 2010/01/27 (水) 13:43:29 - JPO 下記の特許庁のWebページなども参考にしてはいかがでしょうか。 http://www.jpo.go.jp/shiryou/s_sonota/hyoujun_gijutsu/kakusan/tt1302-061_kakusan.htm ４−２−１ 非特異的増幅への対策 ４−２−３−３ degenerate ＰＣＲ など

(無題) 削除/引用 No.1979-4 - 2010/01/27 (水) 12:48:21 - Lui 昔、Step down PCRでやっていた経験があります。 Tmがわからないときには有効な手だと思います。

ありがとうございます。 削除/引用 No.1979-3 - 2010/01/27 (水) 11:57:17 - Mario Pumpkin様 温度のレンジ設定に関して、大変参考になりました。 本当にPCRしてみないと分からないと思うのですが、まずはアドバイスいただいたように50℃、55℃から試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1979-2 - 2010/01/27 (水) 11:03:26 - Pumpkin 縮重プライマーということで、（100%マッチに比べて）既に特異性は十分に低いわけです。ですから、あまり高い温度でアニールをさせようと思っても、すぐに乖離してしまって、PCRがかからないということが考えられます。 ですが、こればっかりはPCRかけてみないとわからないので、僕なら50℃、55℃を並行してやります。50℃でスメアだけど、55℃でdisitinctなバンドが出れば、60℃を試します。50℃でdisitinctなバンドが出て、55℃で出なければ、52℃というように狭めていきます。下限値や上限値から始めると、際限なく条件設定出来てしまうので、レンジは決めてやった方が近道だと思います。 ちなみに、40℃のアニールで拾った経験もあります。

ディジェネレートプライマーのアニーリング温度について 削除/引用 No.1979-1 - 2010/01/27 (水) 10:39:34 - Mario ディジェネレートプライマーのアニーリング温度について教えていただきたく思います。 これから使おうとしているプライマーは3種類の配列をアセンブルし、コンセンサスを用いたディジェネレートプライマーです。論文を見る限りではTm値などの記載はなく、アニーリング温度も自分で決めなくてなならないのですが、どのようにしたらいいのか今一つ自信がないので皆さんに教えていただきたく思います。 まず、各配列を個々にTm値を計算すると（Nearest Neighbor法で塩濃度50mM、プライマーの終濃度0.2μM；要はABI9700についているTm値計算機能）フォワードは47.4℃、44.4℃、47.7℃です。リバースは45.5℃、38.6℃、45.1℃です。 また、ディジェネレートプライマーの配列をそのまま、とあるHPのTm値計算ツールを使うと（Current Protocols in Melecular Biologyに準拠した式とのこと。YとかWとかを入れられるツールがここしか見つかりませんでした。。。）フォワードが44.0℃、リバースが41.0℃になります。 この状況の場合、どのようにしたら最適なアニーリング温度を見つけられるのでしょうか。 私としては、後者のディジェネレートプライマーの配列を元に計算されたTm値（F:44.0℃、R:41.0℃）を参考に5℃から10℃の範囲で温度を上乗せしたアニーリング温度で、最適化を行おうと思っています。 ディジェネレートプライマーという都合上ディジェネレシー？が高いと思うのであまり低い温度でアニーリングしてしまうと非特異反応が激しくなりそうなのでまずは47.5℃くらい（あんまり根拠はないのですが、44.0+41.0=42.5これに5℃加えて47.5℃、、、こんなんでいいのでしょうか・・・）でやってみようと思っているんですが、こんなやり方非常識でしょうか。。。 このようなPCRのご経験のある方、お知恵をお借りできないでしょうか。 よろしくお願いいたします。

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