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(無題) 削除/引用 No.1975-6 - 2010/01/27 (水) 22:41:08 - fujii > とあるので、論文どおりにやったのにできない、という話かと思いきや、論文を読んでも読んでもSDSは出てこない… 精製したSRをウエスタンのサンプルにする場合，SDS-PAGEを行わないといけないのでSDSを加えました．参考にした論文にはそのことについて書かれてはいませんでした． > 論文のプロトコール通りに精製→脱塩→サンプルバッファーに溶かす > でプロトコールから逸脱せずに解決できるのではないですか？ そうですね．そうすることで出来るようになるとは思います． > という、それらの論文はみな同じ目的のために精製しているのですか？それとも、目的はどうあれ、SRの精製法で論文に載っているのはこの方法だけ、ということですか？ 目的は論文によって異なっています．目的によってプロトコールが若干ことなるようですが私が行いたい実験をしている論文をたどり，大元の論文のURLを貼りました． 説明が上手くできておらずご迷惑をおかけしました みなさますみませんでした

よくわからないのですが 削除/引用 No.1975-5 - 2010/01/27 (水) 20:24:31 - mom-a >この論文のプロトコールに従ってSRの精製をやってみたのですがどうもSDSが溶けずに困っています． とあるので、論文どおりにやったのにできない、という話かと思いきや、論文を読んでも読んでもSDSは出てこない… PDFさんが解読されたように論文どおりに精製した後SDS-PAGE用のサンプルバッファーと混ぜた、ということであれば、PDFさんのおっしゃるようにすれば 論文のプロトコール通りに精製→脱塩→サンプルバッファーに溶かす でプロトコールから逸脱せずに解決できるのではないですか？ と思えば、今度は >KClを含まないsolutionを調製して同様に行うとSDSは沈殿せず，またウエスタンブロットによりSRのマーカーであるリアノジン受容体を観察することができました ということですが、「論文のプロトコールに少し反するような」というのは聞かなくてもわかりますよね。 反していてもいいかどうかは、精製したSRの使い道によるのではないですか？ >別の方法をさがしても，結局この論文にたどり着きます． という、それらの論文はみな同じ目的のために精製しているのですか？それとも、目的はどうあれ、SRの精製法で論文に載っているのはこの方法だけ、ということですか？

(無題) 削除/引用 No.1975-4 - 2010/01/26 (火) 20:35:42 - fujii ご返事ありがとうございます 実際にKClを含まないsolutionを調製して同様に行うとSDSは沈殿せず，またウエスタンブロットによりSRのマーカーであるリアノジン受容体を観察することができました 私の研究室ではKClを含んだバッファーを用いておらず，またSRの精製も行ったことがないので普段使わないKClが何のためかはわかりませんが重要だと考えていました KClを含まないという点で，論文のプロトコールに少し反するような気がするので質問させていただきました

(無題) 削除/引用 No.1975-3 - 2010/01/26 (火) 18:50:36 - PDS よく分からないのですが、カリウムを含むバッファーで分画したサンプルをSDS-PAGE用のサンプルバッファーと混ぜたら沈殿が出たということでしょうか。 それでしたら、ぽんさんのお書きになっているように、ドデシル硫酸のカリウム塩の溶解度がナトリウム塩よりずっと低いことが原因です。何らかの方法で脱塩する必要があります。

詳細はわかりませんが、 削除/引用 No.1975-2 - 2010/01/26 (火) 16:46:42 - ぽん SDSはカリウムイオンと結合して沈殿すると思います。プラスミド調製の時のsolutionIIIの反応がそれを利用しています。 もしかすると、沈殿を作らせることを精製に利用しているのかもしれません。

フラクション分けのバッファーについて 削除/引用 No.1975-1 - 2010/01/26 (火) 14:19:10 - fujii http://circres.ahajournals.org/cgi/reprint/25/6/781 この論文のプロトコールに従ってSRの精製をやってみたのですがどうもSDSが溶けずに困っています．（SDSのファイナル濃度は2%です） バッファー内にKCl（塩化カリウム）を溶かしているからSDSが溶けないみたいなのです．このKClを加えないといけない理由も良くわかりませんし，別の方法をさがしても，結局この論文にたどり着きます． よろしくお願いいたします

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