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(無題) 削除/引用 No.1973-11 - 2010/02/02 (火) 02:29:30 - みゅー みなさま、本当に回答ありがとうございます。 この実験はプレミックスsolu.を作製し検討しています。 やはり、技術的な要因、あるいはちょっとした不手際的なもの(もとのサンプル自体が均一でなかったなど）が原因かなと感じました。 いづれにしても、正確に実験できれば脊髄組織からＲＮＡを抽出できるということはわかり、ほっとしています。 もう一度、丁寧に実験をやり直してみます。

(無題) 削除/引用 No.1973-10 - 2010/01/29 (金) 11:28:19 - Pumpkin mom-aさん、苦労人さん 良く読まずに噛みついて申し訳ありませんでした。semi-quant.ということで了解しました。

横から 削除/引用 No.1973-9 - 2010/01/29 (金) 11:22:32 - mom-a >これはどういう意図ですか？苦労人さんの言われているRT-PCRはreal timeという意味で使われているのですよね。 いや、苦労人さんはreal timeでない、PCR産物を電気泳動してバンドの濃さを比較するRT-PCRのことを言っているのですよ。「半定量」というヤツです。だから、下記のような表現が出てくるのでしょう？ >cDNAの希釈倍率を1.5倍、2倍、3倍、4倍、8倍という風にいろいろ替えて、GAPDHのバンドが同じになるまで、何度もPCRするしかないでしょう。 >GAPDHのバンドの濃さの違いは、ほんの少しならあってもいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1973-8 - 2010/01/29 (金) 10:33:10 - Pumpkin 苦労人さん >いずれにせよ、RT-PCRの定量性自体を信じていない人が多いです。 これはどういう意図ですか？苦労人さんの言われているRT-PCRはreal timeという意味で使われているのですよね。フローの個々においてしっかりと基準と補正が行われれば定量性があると思うのですが。少し前はreal time PCRの結果を出してもNorthernで確かめなさいと言われましたが、いまではreal time PCRの結果だけで発現差を論じていると思います。maicro arrayについてのvalidはreal time PCRでやるのが普通ですし。

(無題) 削除/引用 No.1973-7 - 2010/01/29 (金) 05:01:53 - 苦労人 プレミックスという意味ですが、例えば cDNA 1ul taq polymaerase 0.5ul primer pair 5ul 2X buffer 25ul water 18.5ul total 50ulのスケールでPCRをやりたい場合、 サンプルがたくさんある場合(例:10個以下)は、 10倍のスケールで taq polymaerase 5ul primer pair 50ul 2X buffer 250ul water 185ul をよくピペッティングしてかき混ぜてから、おのおののサンプル1ulに49ulづつ加えるというだけです。taq 0.5ulを正確にピペッティングするのは難しいですが、この方法だと誤差が少なくなります。みんなやってると思います。 それでもだめなときは、cDNAの希釈倍率を1.5倍、2倍、3倍、4倍、8倍という風にいろいろ替えて、GAPDHのバンドが同じになるまで、何度もPCRするしかないでしょう。 いずれにせよ、RT-PCRの定量性自体を信じていない人が多いです。 GAPDHのバンドの濃さの違いは、ほんの少しならあってもいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1973-6 - 2010/01/28 (木) 11:12:20 - みゅー たくさんの回答、ありがとうございます!!!(＾＾)// 返信、遅くなり申し訳ありません。 ー苦労人さんー プレミックスソリューション？って何でしょうか？？ 申し訳ないのですが、良かったら教えていただけないでしょうか。ｍ(_ _)ｍ 脊髄は腰膨大部を用いています、組織はマウス脊髄で15-20mgです。 promegaのtotal RNA isolation kit　と　RNAeasy lipid tissue mini kit、さっそく検討してみたいと思います!!!

(無題) 削除/引用 No.1973-5 - 2010/01/27 (水) 20:58:32 - POM ラット脊髄からRNAを抽出していました。 私は初め、Trizolでの抽出を用いていましたが、そのときは初心者だったためかうまくいきませんでした。脳組織は脂肪含有量が多いため、RNeasy lipid tissue mini kitがよいとどこかに書かれていた（ような気がします）ので、脊髄もそうかなと思い、そちらに変更しました。胸髄T10レベルで4mmほどの組織（20-30mgだった気がします）から、抽出しましたが、この方法で10mgあたり2-3ugとれました。これは微量といえば、微量かもしれませんが、大体これぐらいではないかと。ただ、今思うと、脂肪というより、組織重量あたりの細胞数が少ないことがRNAの収量が上がらない原因かなとも思います。この点についてはあまり定かではないですが。RNA抽出はkit内のlysisを使い乳棒でぐりぐりやるという原始的な方法でしたが、ちゃんととれましたよ。

(無題) 削除/引用 No.1973-4 - 2010/01/26 (火) 15:03:33 - 苦労人 >さらに抽出後に濃度をそろえてPCR定量すると、サンプルによってGAPDHなどの表れ方が全く違っていたりします。 mRNAから逆転写したcDNAをtemplateとして、RT-PCRで比較したということですよね。 GAPDHのバンドの濃さなどは、サイクル数によりますが、ピペッティング操作次第ではサンプル間で大きくかわる場合もあると思います。プレミックスソルーションを使ってピペッティング操作を慎重にやってもだめですか？

(無題) 削除/引用 No.1973-3 - 2010/01/25 (月) 17:09:33 - CJ 脊髄に脂肪組織が多くてっていうくだりが引っかかりますね…。脊髄に脂肪があるとは考えがたいですが。脊髄や脳は基本的にはＲＮＡ抽出しやすい組織だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1973-2 - 2010/01/25 (月) 16:32:09 - aaaa_tsu 脊髄の腰膨大部か頸膨大部のどちらかから採取したことがあります。 みゅーさんの場合はどの部位でしょうか、全体ならかなり多いと思いますけど。 どうされているのでしょうか。 ちなみに、 私の場合は、腰髄なら2-3ブロック(L2-4)位で、 promegaのtotal RNA isolation kitを用いて回収しています。 普通にlysis bufferでホモジネートして、dilution bufferを入れてから、神経系の組織なので、一度、1mlのシリンジに通します。 ホモジネートは回転式のものを使用しています。 注射針に一度通すことでしょうか。 この過程を経ないと、遠心したときに、ペレットが もわもわした状態になり、きれいにRNAが取れない気がします。 そのほかの作業は、キットのプロトコール通りやるだけできれいにRNAは回収できましたよ。 参考になればよいのですが。

脊髄組織のＲＮＡ抽出 削除/引用 No.1973-1 - 2010/01/25 (月) 15:10:48 - みゅー 　脊髄組織からＲＮＡ抽出をしたいと考えており、現在基礎検討しているのですが、脂肪組織が多いためか、通常の抽出方法だとごく微量しかとることができない、さらに抽出後に濃度をそろえてPCR定量すると、サンプルによってGAPDHなどの表れ方が全く違っていたりします。 　実験方法は、ＴＲＩ−ｚol中でたまに熱を冷ましながら超音波破砕し（３−５分）、その後クロロホルム抽出、EtOHpptなど一般的な方法でひととおり抽出し、tRNAの濃度測定→定量　を行っています。 　もうこのような実験を５回以上繰り返しているのですが、問題点が全くわかりません。。。どなたか助けてください。。。

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