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ありがとうございます 削除/引用 No.1972-8 - 2010/01/26 (火) 14:56:34 - nushi 腸管さん おっしゃるとおりで、 可溶性にいってるが、蛍光が弱いということです。

(無題) 削除/引用 No.1972-7 - 2010/01/26 (火) 08:41:11 - 腸管 精製してほとんど取れないのなら 可溶性にはないということでしょうか？？？ SDS-PAGEで確認されているのでしょうか？ それとも、蛍光でしょうか？ もし、不溶性にいってしまっているなら 低温誘導しかないのでは？ 低温なら、プロテアーゼによる分解も抑えれますし・・・ 蛍光での確認のみであるなら もしかしたら酸化還元状態が影響しているかもです ttp://catalog.takara-bio.co.jp/clontech/PDFFiles/PT2040-1_j.pdf 上記の9ページにそのような記載が・・・ それなら、宿主をOrigamiとかに変えてみるのもよいかもですが・・・ 可溶性にいっていても蛍光がないとかでしょうかね？？？

ありがとうございます 削除/引用 No.1972-6 - 2010/01/25 (月) 16:51:08 - AS うさん 精製しています。 2LでpAcGFP-His、pAcGFP-His-Aはほとんど取れません。 細胞に投与する量が足りてません。

(無題) 削除/引用 No.1972-5 - 2010/01/25 (月) 16:39:20 - 中年 lacプロモーターによる発現なら、T7ポリメラーゼをlacプロモーターから発現するようになっているBL21(DE3)株を使う必要はありません（つまり、BL21株でＯＫ）。まあ、BL21(DE3)株を使ってもそれほど問題はないでしょうが。

(無題) 削除/引用 No.1972-4 - 2010/01/25 (月) 16:10:31 - う よくわからないので、質問させてもらいます。 結局、それらの大腸菌から精製してみたのでしょうか？ もし、してなかったら、してみては？ もし、しているのであれば、どのくらいの大腸菌からどのくらいのタンパク質が取れたのか？ ＞よって、pAcGFP-His、pAcGFP-His-Aがもっと大量に必要になってくるのですが、 このように書かれてあるが、この文章より前の文章では どのくらいタンパク質が回収されたのかわからない。 「もっと大量に必要」という、なにを基準に「もっと」なのか？ この辺がわからないので、何ともいえません。 以上のことは示された方がいいと思います。 それと、むずかしく考える前に、大腸菌のカルチャー量を単純に増やすという手もあります。

ありがとうございます 削除/引用 No.1972-3 - 2010/01/25 (月) 16:09:10 - AS 精製できたpAcGFP-His-Bは、細胞に投与してみたのですが、 FITC換算濃度で10μMから50μMないと フローサイトおよび共焦点顕微鏡では観察できませんでした。。。

(無題) 削除/引用 No.1972-2 - 2010/01/25 (月) 15:43:06 - ~ タンパク質の必要量が分かっていない状態なのですよね。 本当に発現条件や細胞株を変える必要があるのですか？ >また、細胞にタンパクを投与するのってどのくらいタンパク質が必要なのですか？ それは実験者が決めることだと思いますが… タンパク質導入試薬を見ると、ug単位で導入が可能と書かれているものが多いですね。 ただ、それは試薬として導入可能な量であって、貴方が導入する量は、貴方が決めることでしょう。 分子量や活性によって、数桁投与量が変わってもおかしくないと思います。 膜透過シグナルをつけたタンパク質を細胞に導入するというのは、先行研究がありますよね。 そこで使用されている量は参考にならないのですか？

GFP融合タンパクの発現誘導、お願いします。 削除/引用 No.1972-1 - 2010/01/25 (月) 13:42:37 - AS AcGFPに１０塩基ほどのペプチド（２種類でA、Bとする）を導入したGFP融合タンパクの発現誘導の条件を探索しています。 pAcGFPはlacプロモーターです。 まず、 後の精製のためpAcGFPのC末にヒスタグ(pAcGFP-Hisとする)を導入しました。 このC末にペプチドA、Bを導入しました(pAcGFP-His-A、pAcGFP-His-Bとする)。 大腸菌は今のところJM109とBL21(DE3)を用いました。JM109はlacプロモーター、BL21(DE3)はT7プロモーター。←ちなみに、この違いって関係あるのですか？ ともにpAcGFPの発現はコロニーの段階から確認できるほどなのですが。 残り３種類、pAcGFP-His、pAcGFP-His-A、pAcGFP-His-Bの発現はコロニーの段階でほとんど見れません。 しかし、pAcGFP-His-Bは続くIPTG添加による大量発現、精製の過程（IPTG:0.1mM、発現誘導時間16時間、温度37度）で大量に得られたのですが、残り２種類pAcGFP-His、pAcGFP-His-Aは少し蛍光が確認できるほどなのですが、pAcGFP-His-Bと比べると数十倍の発現量（蛍光レベル）の違いがあります。 pAcGFP-His-Bは大腸菌回収の段階で、ものすごい緑になってます。 今後これらを精製し、細胞に投与したいと考えています。A、Bは細胞透過性ペプチドです。 よって、pAcGFP-His、pAcGFP-His-Aがもっと大量に必要になってくるのですが、解決策としてどういったことが挙げられるでしょうか？ また、細胞にタンパクを投与するのってどのくらいタンパク質が必要なのですか？ 解決策として、以下を考えています。（この発現誘導が本業ではないので、できれば時間はかけたくないです。） 大腸菌を変える。（なにがおすすめか教えてくださるとうれしいです） 発現誘導温度を下げるかつ時間を延ばす 無細胞翻訳系などに切り替える。 言葉足らずな部分もあるかと思いますが、以上よろしくお願いします。

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