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ありがとうございます。 削除/引用 No.197-12 - 2009/03/19 (木) 10:41:14 - プロテインGセファロース 通りがかり様　ありがとうございます。 ご連絡遅れてすみません。 エンテロキナーゼについての問題点のご指摘ありがとうございます。 Flag短いですし、抗体に結合した状態で認識できるかは 確かに重要でした。ありがとうございます。 Flagペプチドについて、うちのラボで誰もやったことがなくて、 どうなのか？という懸念があったのですが、 通りがかり様のお話ですと、収率はよさそうなので、 検討したいと思います。 本当にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.197-11 - 2009/03/18 (水) 09:54:41 - 通りがかり エンテロキナーゼは抗体が結合した状態でも効くんでしょうか。 単純に考えれば、抗体で認識配列がブロックされてしまいそうですが。 Flag 融合蛋白は数多く作ってますが、 Flag peptide は普通に使えます。 Flag-M2 agarose で精製した蛋白を 100~200ug/ml Flag peptide で問題なく溶出できます。 レジンに結合した蛋白の大半が回収できていますよ。

ありがとうございます。 削除/引用 No.197-10 - 2009/03/18 (水) 01:38:46 - プロテインGセファロース 通りがかり　様　ご連絡ありがとうございます。 Flagと蛋白の間に切断部位挟むのもいいですね。 GST-トロンビンみたいな感じと考えます。 検討してみます。 さらにいろいろ検討してたのですが、 SIGMAにFlagマーカーを切断する、エンテロキナーゼをみつけました。 http://www.sigma-aldrich.co.jp/sigma/Protein/flagtech/flag_marker.htm Flagごとanti-Flag+Protein Gをきってしまって、 完全な精製蛋白にしようかと考えています。 まだ手に入れてもないのですが、 もしこれを使ったことがある方がいましたら、 特に反応時間や、酵素量、反応温度など 感触を教えていただければありがたいです。 またエンテロキナーゼ反応バッファーが蛋白変性に及ぼす影響など ご存知でしたら教えてください。 Flagペプチドによる溶出は抗体のアフィニティーが強いので、 どれだけ溶出できるか不安なので、 買うのはためらってます。 やはりProtein Gからの溶出は難しそうなので、 上記のエンテロキナーゼか、 通りがかり様に教えていただいたような、 切断部位による切断を考えたいと思います。 エンテロキナーゼについてや ほかの方法何かご存知の方いましたら、教えていただければありがたいです。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.197-9 - 2009/03/17 (火) 17:49:16 - 通りがかり Flag タグと目的蛋白の間にプロテアーゼの認識配列を入れておいて、Protein G で精製後にプロテアーゼで切り出すというのはどうでしょう？

ありがとうございます。 削除/引用 No.197-8 - 2009/03/17 (火) 17:03:23 - プロテインGセファロース IP様、み様　御連絡ありがとうございます。 IP様、教えていただいたグリシンによる蛋白への影響は 重要な情報ですので、参考にいたします。中和の仕方など、 グリシン使う際には1M Tris(pH 8.0)でやろうと思います。 み様、文献紹介も含めありがとうございます。 ご指摘のようにProtein Gとanti Flag M2の結合は共有結合かどうか 分からないみたいで(GEに聞いてもFc部分の結合様式は分からない とのことでしたが)、pH2ぐらいまでもっていくと抗体作成みたいな感じで 抗体も抗原側に出て行くかもとのことでした。 pH 4.0ぐらいにもっていったらどうでしょう？と言われましたが、 どんなものなのでしょうか？ またご紹介いただいた論文なのですが、いそいで読んでみたのですが、 強制発現したものでSuper Shiftしているようにみうけられます。 (読みが足りなければすみません。) 本当に私のしたかったのは、この論文と同じようにある蛋白を 強制発現させて、その抗体でSuperShiftをみることだったのですが、 抗体があまりいいものではなく、仕方なくFlag融合蛋白をGel shiftして anti-FlagでSuperShiftすることを目標としましたが うまくいきませんでした。 そこでSuperShiftがどうしても出せないので、正当ではないのですが、 Flag融合蛋白を精製し、それをgel Shiftで流して、バンドがでれば、 SuperShiftを回避してFlag融合蛋白の結合を間接的に 言いたいと思っています。 したがって、anti-Flagが抗原側に出てきてもcontrolとの間で 差が出ればいいかな？と思っています。 ただ抗原-抗体の結合した状態が、DNAとの結合にどのような影響を 与えるかは評価できないので、あまりいい方法ではないのかもしれません。抗原-抗体だけを切って、うまく溶出する方法はないものでしょうか？ Flagペプチドは買えないので、できそうにありません。 いいアイデアあれば教えてください。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.197-7 - 2009/03/17 (火) 11:22:54 - み flag抗体はproteinG-sepharoseに共有結合されていますか？ 共有結合していないと酸溶出などではflag抗体も抗原側のフラクションに来ますね。その場合、ゲルシフトにもっていく蛋白サンプル内に常にflag抗体が存在する状況下になり、super shift のコントロールとして横に流すであろうcontrol IgGのレーンでも、持込のflag抗体が作用してsuper shiftが起ってしまい、コントロールにならない。 改変法として、蛋白側を精製せずにできると思います(抗原量が無茶苦茶稼げる強制発現系ですよね）。以下の論文でその方法によるゲルシフトやっていたと思います。 Cell Metabolism 2008 Jan;7(1)86-94 Interferon regulatory factors are transcriptional regulators of adipogenesis

(無題) 削除/引用 No.197-6 - 2009/03/17 (火) 07:21:27 - IP 蛋白質によるのでこれは一概には言えることではありませんが、抗体の精製のときはグリシンー塩酸pH2.0で溶出したあとで、速やかに中和すれば問題なくいけてます。いまのところこれで失活したことはありません。普通に使えてます。この場合は１MくらいのTris pH8.0くらいのbufferを少しずつ入れてpH試験紙でチェックしてます。とりあえず中性ないし弱アルカリくらいになったことを確認するだけで、そんな厳密には合わせてません。あらかじめ予備実験で酸性溶出液とTrisがどのくらいの量比だと中和できるか知っておくとやりやすいです。あと、やったことないですが高pHでも溶出できるそうです。また抗体カラムからの抗原蛋白質の溶出では高濃度のMgCl2を使う方法もあるようです。 あと抗体と抗原の結合が非常に強い場合、pH2.0でもまだ出てこないこともあるという注意を実験書で見たことがあります。

ありがとうございます。 削除/引用 No.197-5 - 2009/03/16 (月) 22:54:12 - プロテインGセファロース み　様 適切な回答ありがとうございます。 いろいろ知らなかった自分が恥ずかしいです。 現在のところ、anti-Flag M2抗体を使っており、 Flagペプチドを使うのがもっともよさそうなのですが、 Flagペプチドはありませんし、今の資金難では当分手に入りません。 Ca依存性でもなく、1M NaClまでは使用可能ということから、 EDTAもNaClも難しいのかもしれません。 今のところグリシンによる酸溶出を考えています。 教えていただいたサイトからさらに http://www.sigma-aldrich.co.jp/sigma/Protein/flagtech/a2220_a.htm と http://www.sigma-aldrich.co.jp/sigma/Protein/flagtech/trouble.htm を参考にさせていただきました。 今やろうとしていることなのですが、Flag融合蛋白を anti-Flag M2抗体とProtein G Sepharose™ 4 Fast Flowと 結合させて、落としてきて溶出し、 その溶出サンプルでgel shiftでみたい遺伝子のプロモーター部位から 作ったDNA probeと結合させることを考えています。 gel shiftでSuperShiftがうまくいかなくて、苦肉の策なのですが・・ DNA-蛋白の結合のため、できるだけ蛋白の変性はひかえたいので、 SDS buffer+熱処理は選択しなかったのですが、 グリシンによる酸溶出の蛋白変性に対する影響は大きいのでしょうか？ もしご存知でしたら教えてください。

(無題) 削除/引用 No.197-4 - 2009/03/16 (月) 20:26:23 - み そのプロトコールの注意書きなど、細部に目を通すべきです。 なぜEDTAという選択肢がでてきたのやら・・・・ http://www.sigma-aldrich.co.jp/sigma/Protein/flagtech/a_flag_a.htm が参考になります。 FLAG M1抗体は抗原認識にカルシウムを必要とするようです。 ですから溶出に2mM EDTAが使用できるのです。 ちなみにこの抗体は「1M NaClまたは１M尿素でも使うことができます。」と記載されているので質問文に記載されているNaCl溶出は使いにくいですね。 抗原抗体反応がCa2+依存的であるのは珍しい例ですね。 他の抗体を使用されているなら普通の濃度のEDTAでは溶出できませんよ。 溶出させた後の処理により、溶出法の優先順位が決まってきますね。

調べ中です。 削除/引用 No.197-3 - 2009/03/16 (月) 18:59:57 - プロテインGセファロース み　様　 連絡が遅くなってすみません。 メッセージありがとうございます。 anti-Flagの抗体について、Ca2+ 依存性かどうか、 気にしたことがなかったので、調べているところです。 まだ調べ中なのですが、Ca2+依存性というのが いまいち分かりません。 抗体にCa2+依存性とかあるのでしょうか。 それはRegentのことなのでしょうか？ もしよろしければ、抗体の何がCa2+依存性か？など、 調べるヒントになるキーワードがあれば教えていただけませんか？ よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.197-2 - 2009/03/16 (月) 12:28:55 - み flag抗体にはCa2+依存性のものと、そうでないものがあるはずです。 あなたが使用しているものは依存性でしょうか。それならEDTAによるキレートで溶出できるのでしょうが。濃度は知りません。 私なら真っ先にflag-peptideでの競合溶出を考えますが。

プロテインGセファロースの分離について 削除/引用 No.197-1 - 2009/03/16 (月) 02:56:59 - プロテインGセファロース プロテインGセファロースと目的となる蛋白/抗体を SDS以外で分離することについて教えてください。 プロテインGセファロースをつかって、 強制発現したFlagつきの融合蛋白を免疫沈降し、 蛋白精製したいと思っています。 ウエスタンブロットではないassayに使いたく、 蛋白構造もあまり変えないで行いたいのですが、 このプロテインGセファロースと蛋白/抗体(anti-Flag:mouse) を分離するのに、SDS以外で、0.2-1M NaClやEDTAを使うと プロトコールの本で読んだのですが、 この0.2-1M NaClをサンプルあたり何μlか、 またEDTAは何mol/lで何μlをサンプルあたりいれるのか、 ご存知でしたら教えてください。 ただNaClやEDTAで構造変化が起こるかどうか分からないのですが、 別によい方法をご存知の方がいたら教えていただければ ありがたいです。 よろしくお願いします。

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