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(無題) 削除/引用 No.1959-9 - 2010/01/22 (金) 23:13:47 - Boston ; 様もご指摘ですが、ヘキスト染色で生細胞の DNA を染めることができます（UV ランプが必要ですが）。 「ある遺伝子の下流にGFP遺伝子」とは GFP 融合タンパク質ということでしょうか？それとも、ある遺伝子プロモーターを用いて GFP を発現させるのでしょうか？ もし、後者であれば、ちょっと実験のデザインに疑問があります。プロモーターが活性化する時間とGFP が蛍光を発するまでの時間との間にタイムラグが生じるからです。そうすると GFP 陽性細胞の細胞周期を調べても、タイムラグの分を補正しなくてはなりません。

(無題) 削除/引用 No.1959-8 - 2010/01/22 (金) 21:21:25 - TK−１ 1%pFAで15分固定、DAPIか7AADを入れて終わりです。 それ以上何か要りますか？

(無題) 削除/引用 No.1959-7 - 2010/01/22 (金) 19:02:47 - ggg ごんべい様 たびたびありがとうございます。 通常のプロトコルではEtOHだと-20℃で一晩以上で…とありますよね。 その場合でも、細胞質内のGFPは大丈夫ってことでしょうか？ 今やろうとしているTGマウスではGFP細胞が少ないため、lossをとても心配しています。。。 今度PIでも染めてみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1959-6 - 2010/01/22 (金) 18:51:23 - ごんべい あと、DNA染色は断然PIがCVがよいです。

(無題) 削除/引用 No.1959-5 - 2010/01/22 (金) 18:49:55 - ごんべい >1%PFA後のEtOH処理はどのくらいの時間おかれてるのでしょうか。また反応は4℃でしょうか？ EtOHのみの時にならってフリーザーに一晩以上は置いています。 その方が良いと言われているので。 あとは時間のある好きな時に解析しています。 この時間についていろいろと検討したことはないのでよく分かりません。

(無題) 削除/引用 No.1959-4 - 2010/01/22 (金) 18:30:59 - ggg ごんべい様 回答ありがとうございます。 4%PFAはよくないみたいですね。 1%PFA後のEtOH処理はどのくらいの時間おかれてるのでしょうか。また反応は4℃でしょうか？ ；様 回答ありがとうございます。 DNAのみを染めようとしています。 生きた細胞の場合はHoechst33342でそめればよいのでしょうか？ その時には何かに細胞に対して処理は必要でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1959-3 - 2010/01/22 (金) 18:02:16 - ； DNAを染めるだけですか？他のセルサイクル関連の因子を検出するのですか？ DNAだけなら生きた細胞のままでもいいと思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.1959-2 - 2010/01/22 (金) 14:21:52 - ごんべい 4% PFAはCVがかなり悪くなります。 TX-100では可溶性タンパク質が流れてしまいます。 1% PFA on ice 15 minの後70% EtOHでやっています。 それでも70% EtOHのみよりCVが悪くなりますがかなりましです。

GFP陽性細胞の細胞周期解析　2 削除/引用 No.1959-1 - 2010/01/22 (金) 13:44:32 - ggg 教えていただきたいことがあります。ある遺伝子の下流にGFP遺伝子をいれたTGマウスについてそのGFP陽性細胞における細胞周期をFACSで調べたいと考えています。 FACSで細胞周期解析を行うときはエタノールで固定＆膜透過処理がスタンダードのようなのですが、GFP局在が細胞質なためGFPが流出してしまうことから固定は4%PFA/PBSで行おうと思っています。またDNA量はDAPIで見ようと思っています。 また、Triton-Xを用いての膜透過処理が難しいように考えているのですが、このような場合、どのような膜透過処理等を行っておられるのでしょうか？濃度をふればどうにかなるのでしょうか？ 0.3%Triton-Xのバッファーで処理するとDNA量はうまく量れたのですが、GFP細胞が減少したように感じました。 回答いただければ幸いです。

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