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(無題) 削除/引用 No.1951-11 - 2010/01/22 (金) 15:34:14 - ； 継代するときの細胞の状態によっても、細胞の増えの立ち上がりが悪いときも。 そもそも、薄すぎでまいた場合は細胞には良くないところに、 そのときの細胞の状態が悪ければさらに影響が大きいときもあります。 培地が黄色くなっていなければ大丈夫って簡単な話じゃないですよ。

(無題) 削除/引用 No.1951-10 - 2010/01/22 (金) 13:54:58 - DC 実験に使用するまで、Tフラを立てて培養していようが横にしていようが細胞は増えていたわけですから、継代操作（増殖因子云々）に問題はないのではないでしょうか？ もちろん、みなさんが仰るようにConditioned mediumを一部残す事は必要な操作ですが。 そうすると、すでにご指摘のあるような、遠心時のgが強すぎたり遠心時間が長すぎるといった点や、遠心後にRe-suspendして継代用に回した細胞がかなり低密度であった（この場合は増殖因子が原因だとは思いますが）といった事が原因では・・・？ 特に、質問者さんの書き込みを拝見しますとセルカウントをしていない傾向だと思いますので、継代に回した細胞が実はかなり少ない細胞数、というオチも・・・

(無題) 削除/引用 No.1951-9 - 2010/01/21 (木) 20:07:47 - c 遠心をされているということですが、遠心条件が強すぎるという事ではないでしょうか。条件が強いと細胞がダメージ受けます。細胞集める場合は、せいぜい500xg程度で、2~4分くらいが普通と思いますがどうでしょうか。また継代ならばいちいち遠心して集めなくても、単に細胞の増えた古い培地を一部とって新しい培地に希釈すればいいのではないかと思うのですが。株細胞で特に何か細胞密度に影響されやすいとかいう性質のものでないならば、問題ないと思いますしその方が、楽だし細胞にも余計なストレスかけずに済むとおもうのです。別に付着系細胞と同じようにする必要はないのですし。

(無題) 削除/引用 No.1951-8 - 2010/01/21 (木) 16:06:04 - ＊ またく異なる視点から書かさせて頂きます。 当方も、浮遊細胞を培養していた事があり、突然細胞の増殖が落ちる、もしくは死ぬと言う現象に遭遇した事があります。 原因が分かるまで実に数ヶ月から半年はかかったでしょうか？ 培地、試薬を全部かえても現象は収まりませんでした。 原因は、co2ボンベのレギュレーターの故障でした。 すぐに分からなかったのは、メーカー点検でもガス濃度に以上を示さず、表示も5%のままでした。 壊れているのに、ガス濃度が復帰するんです。 結局、半年近くもガスが空荷ならないどころか減らないと言う観点から、レギュレーター交換に至り、全症状が解決しました。 不思議な物です。

フラスコの縦置き 削除/引用 No.1951-7 - 2010/01/21 (木) 15:27:48 - mom-a 凍結した細胞を解答した直後など、細胞密度が高い方が生存が良いので、立てて置く（底面積を狭くする）方が良い場合があります。 が、普通に継代できるようになった後はフラスコは横にするのが一般的だと思います。 私が以前培養したことがある白血病細胞株はT細胞系だったと思いますが、Bostonさんのおっしゃるように、フラスコを横にして培養し、継代は1/10量くらいを残して新しい培地を足す、という方法で行っていました。元気に増えていたので目分量で継代していましたが、最初のうちは、細胞数を数えて推奨されている密度になるように調整した方が間違いないと思います。

(無題) 削除/引用 No.1951-6 - 2010/01/21 (木) 14:57:56 - う まず、何細胞なのかわからんので何とも言えない。 何細胞か挙げていないことから、また、文章からも 質問者様が 「細胞を大きな括りで考えている、細胞によって培養条件が違ってくる」 という、大事な認識が欠如していると思われる。 そのことを認識すべき。 Boston様もご指摘だが、私が真っ先に思い立ったのは 細胞自身が作るサイトカインが増殖に重要だったりする。 薄すぎると、そりゃ死ぬ。

(無題) 削除/引用 No.1951-5 - 2010/01/21 (木) 14:31:39 - Boston まず、フラスコを垂直に置いておく理由はないと思います。空気と接する面積はガス交換の効率を考えて、広くした方が良いので。あと継代ですが、完全なメディウム交換は必要ないと思います。１０mLカルチャーなら、１mLをフラスコに残して、新しい培地を９mL加えるようにしていました。 以前、あるトピに対するコメントにもありましたが、細胞自身が産生するサイトカインが増殖に重要である場合があります。そうした意味でも、完全なメディウム交換は適切でないかも知れません。Tリンパ球系ですが、Jurkat はその例です。Bリンパ球系のBaF はどうだったか忘れてしまいました。

(無題) 削除/引用 No.1951-4 - 2010/01/21 (木) 14:17:02 - MP ガラスピペットを洗って使っているのであれば、うまく洗えていない可能性もあるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1951-3 - 2010/01/21 (木) 14:10:55 - ~ >FCSはlot checkによりlab内の色んな細胞が元気に増えるものを当然使用し これでその細胞に使えるロットだとは言えないと思いますが… 血球系で無いと非動化は要らないのでラボでは通常非動化しておらず、 貴方の細胞では非動化が必要と言うことはありませんか？ >RPMI1640で飼育しています。 グルタミンは入っていますか？ 無いと立ち上がらない細胞もあります。 >飼育環境は37℃, 5 % CO2で28 cm^2の小フラスコを垂直に立てて浮遊細胞を飼っております。 動物種が書かれていませんが、37度で良い細胞なんですよね？ 細胞密度は適切ですか？ 薄ければ立ち上がらず、濃いと餌を食い尽くして死ぬことがあります。 >遠心後新しいmediaにsuspendさせることでfreshなmedia交換を行っています。 その細胞でその遠心のgは適切ですか？ 細胞によっては遠心に弱く、遠心しないで継代することもあります。 >残りを継代用に回した時、翌日フラスコを見ると >全滅することが幾度かありました。 全滅しているのは実験に使っている細胞も同じなのですか？

(無題) 削除/引用 No.1951-2 - 2010/01/21 (木) 13:36:35 - TK−１ > 元気に増え、mediaの色が黄色くなる前に、細胞を15 ml tubeに回収し、遠心後新しいmediaにsuspendさせることでfreshなmedia交換を行っています。 まさか回収して、遠心した細胞を全部fresh mediaにsuspendしてまいてませんよね？ > ところが、実験に必要な細胞をそこから取り出し、残りを継代用に回した時、翌日フラスコを見ると > 全滅することが幾度かありました。 細胞の密度を一度チェックされたらいかがですか？一般的なcell lineなら0.5x 10^4 - 1 x 10^6/mlが無難な密度だと思います。 mediaが黄色くなったら、fresh mediaを入れたフラスコに、数滴落としてpassageするのが一般的だと思いますが、遠心してsupをとってまかないといけないくらいgrowthが遅いんでしょうか？

浮遊細胞の突然死について 削除/引用 No.1951-1 - 2010/01/21 (木) 12:51:26 - 浮遊細胞初心者 みなさまにお聞きしたいことがありまして、トピックを立てました。 自分でも何が原因か判らず、困っています。どうか相談に乗っていただけませんでしょうか。 現在、一般的な白血病細胞株（B細胞性リンパ腫）を飼っております。 FCSはlot checkによりlab内の色んな細胞が元気に増えるものを当然使用し、基本となる培養液はATCCやRIKEN cel bank推奨に基づきRPMI1640で飼育しています。 飼育環境は37℃, 5 % CO2で28 cm^2の小フラスコを垂直に立てて浮遊細胞を飼っております。 元気に増え、mediaの色が黄色くなる前に、細胞を15 ml tubeに回収し、遠心後新しいmediaにsuspendさせることでfreshなmedia交換を行っています。 ところが、実験に必要な細胞をそこから取り出し、残りを継代用に回した時、翌日フラスコを見ると 全滅することが幾度かありました。 原因はほんとにわかりません。 他の接着系の細胞は上手くいっておりますので、ガラスピペットを熱し過ぎているとか初歩的なミスではないと確信しています。。 ちなみに今D3です。 非常に情けなくみっともありませんが、浮遊細胞の扱いに多少困惑しておりますので、みなさまも同じような経験があれば、その後、どう対処したのか教えていただけますと幸いです。

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