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(無題) 削除/引用 No.1947-5 - 2010/01/21 (木) 10:42:30 - PEYKUN ~ さん 　アドバイスありがとうございます。 　ＰＣＲ後の産物からテンプレートの濃度を割り出そうとしているのではありません。（説明不足でした。） 　テンプレートはウィルスのＲＮＡからｃＤＮＡにしたもので、そこからあるタンパクコード領域だけのライブラリー（各検体ごと）を作っています。もちろんシングルバンドを確認済みです。またその後の実験の一つ（ライブラリーのプラスミドを使う）にＰＣＲ産物が何μｇ以上とプロトコルに指定されている方法をしなければならず、濃度をできるだけ知りたいのです。

(無題) 削除/引用 No.1947-4 - 2010/01/20 (水) 17:32:36 - ~ そもそもExoSAPIT処理後に吸光度で濃度を見積もること自体に無理があると思いますが、 それ以前にPCR後のバンドの量からテンプレートの濃度を見積もろうとしているのですか？ >シークエンス前のPCR産物の精製に用いることとなりました シークエンシングに回すためのPCR産物ということは、シングルバンドになっているはずですよね。 一部とって泳動すれば、濃度は分かるでしょうし、シークエンシング前ならばその位のサンプル量の余裕はあるのではないでしょうか。 >同じcDNAを使ってライブラリーを作るときに濃度をできるだけ統一したいことがあり、それでできるだけ正確な濃度を情報として残しておきたいのです。 ライブラリーを作るということは、シークエンシング用のPCRをかける前のcDNAの濃度の話ですよね。 シークエンシング用にPCRをかけたバンドの濃度は半定量的ではなく、 これを元にサンプル間のcDNA量を見積もるのは無理があるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1947-3 - 2010/01/20 (水) 14:50:19 - PEYKUN AP様 　情報ありがとうございます。 　やはりdNTP等の影響がありますか。 　シークエンスではアバウトな濃度で良いとは思いますが、同じcDNAを使ってライブラリーを作るときに濃度をできるだけ統一したいことがあり、それでできるだけ正確な濃度を情報として残しておきたいのです。

(無題) 削除/引用 No.1947-2 - 2010/01/20 (水) 14:43:14 - AP カラム精製とちがって、基質dNTPやプライマーは除去されず、分解されてdNMP（ヌクレオシドものリン酸のモノマー）がとして残るのだから、当然と思いましたが。 シークエンス目的では、そんなに正確な鋳型濃度は必要でないし、ストライクゾーンも広いので、わたしならいちいち定量しません。外注するとかで、濃度が厳しく指定されているのかしら。

ExoSAP使用時の濃度について 削除/引用 No.1947-1 - 2010/01/20 (水) 14:14:16 - PEYKUN いつもお世話になっています。 　簡単な質問なので、よろしくお願いします。 　最近ExoSAPを購入し、シークエンス前のPCR産物の精製に用いることとなりました。ExoSAPを用いる場合、NanoDrop等で濃度を測定するとA260もA280の値もいつもの3倍以上を示すようになりました。バッファーや酵素がそのまま入っているわけですから、不純物やペプチドの数値が高くなるのは分かるのですが、ここで表示される濃度の数値は信頼しても良いのでしょうか？ 　目的のDNA以外の一本鎖等はすべて分解されてしまっていると考えていいでしょうか？ 　カラム精製よりも3倍程度濃い濃度になってしまったので、質問に至りました。濃度検討が必要なアッセイなので、正確な濃度が知りたいのです。 　ExoSAPを使用している方、アドバイスをお願いします。 皆様からの情報をお待ちしています。

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