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(無題) 削除/引用 No.1942-8 - 2010/01/21 (木) 11:12:10 - 中年 私は古い人間なのかもしれませんが、シングルコロニーから出発していない材料を扱うことには抵抗があります。また、どなたかもお書きになっているように、プラスミドを保存する目的で形質転換体のグリセロールストックをすることも好きではありません。 今回の場合なら、私ならこのようにします。買ってきたプラスミドはそのまま凍結して保存。ごく一部を大腸菌に形質転換して、シングルコロニーからプラスミドを増やしてそれを実験に用いる。これが無くなったら、オリジナルのストックをごく一部大腸菌に形質転換して、またシングルコロニーからプラスミドを増やす。

(無題) 削除/引用 No.1942-7 - 2010/01/20 (水) 17:50:23 - Pumpkin >ちなみにみなさんはどのようにして保存していますか？ 私はストックするならDMSOストック派ですが、どちらかといえばストックしない派です。 大腸菌ストックは、菌株保存の観点では当然行いますが、plasmid保存の観点からはしません。既出のように保存によって脱落する場合があるとも聞きますし、なにより冷凍庫のスペースを案外くうので。やはりplasmidは高濃度でTEに溶解した状態で−20度なりで保存するのがいいと考えています。 多少の実験であれば、高濃度なのでそのまま使えるし、増やす事情があっても言うほど手間でないですよね。大腸菌を起こすときもストリークして、シングルを液培することを考えれば、差はありません。その手間が無駄だというのなら、他の無駄を排除した方がもっと時間を効率的に使えると考えます。 ただ、ボスが違う保存方法に固執していたりすると面倒だったりもしますけどね。

(無題) 削除/引用 No.1942-6 - 2010/01/20 (水) 17:36:17 - ばいや >[Re:5] 丸さんは書きました : > point mutationを避けるためシングルコロニーにあえてしないという理由に納得いたしました。そしてtransformationしたものをそのまま液体培養する方法をとる場合もあることに安心いたしました。 そうすることもあるけど、手抜きです。収量や純度は悪くなるし、均一性も壊れやすいです。それを覚悟でそうするときもあります。 > またあえて大腸菌にいれてストックしない場合はplasmidがなくなったときどうするのでしょうか。再度大腸菌にいれなおして増やすならば大腸菌ストックと一緒のような気がするですが。 > 大腸菌に入れてディープフリーザーで保存しているときに大腸菌が悪さするとも考えにくいですし。 凍結融解するときに何か起こるかもしれませんね。 プラスミドはどの状態が一番安定か知りません。調べたことはないけど、人によっていろいろ言うことが違います。大腸菌に入れる人もいましたが、私は好きじゃないです。理由はフリーザが壊れたり、液体窒素がなくなっていて解けていたら困るから。それに液体窒素は場所をとるしメンテが大変なので嫌。 乾燥やエタノール溶液中もめんどくさいです。増やしたいときに溶液にして、それをまた保存するときに乾燥やエタノールに溶かすのなんて嫌。 だから私はTEにて保存しています。少なくとも私が生きている間に何回凍結融解を繰り返すか分かりませんが、そんなには行わないと思う。その間に重大な欠陥が出るとは思わないからです。 ちなみにみなさんはどのようにして保存していますか？

(無題) 削除/引用 No.1942-5 - 2010/01/20 (水) 17:01:37 - 丸 みなさん お返事ありがとうございます。 point mutationを避けるためシングルコロニーにあえてしないという理由に納得いたしました。そしてtransformationしたものをそのまま液体培養する方法をとる場合もあることに安心いたしました。 またあえて大腸菌にいれてストックしない場合はplasmidがなくなったときどうするのでしょうか。再度大腸菌にいれなおして増やすならば大腸菌ストックと一緒のような気がするですが。 大腸菌に入れてディープフリーザーで保存しているときに大腸菌が悪さするとも考えにくいですし。

(無題) 削除/引用 No.1942-4 - 2010/01/20 (水) 09:41:55 - 大腸菌にいれたまま保存しない プラスミドは（ミニプレップなど）DNAとして保存し、大腸菌にいれたまま保存しないことにしています。 大腸菌で発現するものは、積極的に排除され、DNAパターンが多少ズタズタになることがまれにあります。

(無題) 削除/引用 No.1942-3 - 2010/01/20 (水) 09:37:02 - ~ ラボによって（というか教員ごとに）異なる方針でした。 １．シングルを取って液体培養する シングルを取って制限酵素切断パターンを見て確認しておくことで、問題のないプラスミドと判断する ２．コロニー百個以上をかき集めてから液体培養する シングルをとった場合に、ポイントミューテーションなどは確認していられないため、ミューテーションのリスクを減らすためにコロニー数を増やす ３．トランスフォーメーションしたものをそのまま液体培養する ２と同じ理由の簡略化版 （ただ、自分用に増やしなおすなどで無く、ラボで新しく買ったベクターのストックとしてこの方法を用いるのかは疑問） 私ならばラボのボスに確認を取ってからストックを作ります。 シングルコロニーを取ってはいけないというボスもいましたので、 初心者ならば勝手にシングル化するとも判断すべきではないと思います。

急がば回れ 削除/引用 No.1942-2 - 2010/01/19 (火) 23:26:36 - とおりかがり よっぽどの理由が無い限り（どうせ片手間の半日でしょうし）、そんなところで横着して、もしもの失敗はしたくないので私はやりません。

買ったプラスミドの大腸菌ストック 削除/引用 No.1942-1 - 2010/01/19 (火) 21:10:20 - 丸 お忙しい中、失礼します。 最近分子生物学を始めた大学院生です。 今度買ってきたプラスミドを大腸菌に入れてグリセロールストックを作ろうと思います。 このときtransformationした後にプレート培地にまいて一度シングルコロニーにする必要はあるのでしょうか。 プラスミドは1種類なので直接trasformationした大腸菌を薬剤入りの液体培地で培養しても大丈夫な気がするのですが。 問題がなければ時間も手間も削れるのでよいのですが何しろ初めてなもので不安があります。 経験豊富な皆さんはどうされてますか？ご教授お願いいたします。

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