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(無題) 削除/引用 No.194-13 - 2009/03/20 (金) 19:17:02 - ~ >EGFP, ECFP, EYFP, DsRed, Cherry,,,全てダメでした。 それらのベクターを使ってXL1blueでの蛍光を見る以外の検討はしていないのですか？ 問題が、ベクター自体なのか、XL1blueでの発現なのかは切り分けることが出来るはずですよね。 pQE-Trisystemの元ベクターのはXL1blueで増やすことは出来たのですか？ pQE-TriSystem-EGFP(融合タンパク質などはつけない)はサブクローニングでき、シーケンスを読んで中身の確認はできたのですか？ pQE-TriSystem-EGFPはタンパク質発現用大腸菌株に入れて誘導したら発現したのですか？ pQE-TriSystem-EGFPは適当な動物細胞などに入れたら発現したのですか？ 適当なlacZなどの遺伝子を入れた場合は、サブクローニングできるのですか？その場合の発現(blue/white selection)は見れますか？ XL1blueではプラスミドは維持できるが、発現はしないというのでしたら、 他のクローニング用大腸菌ではどうなのですか？ そういえば、XL1blueのLaqIはF'に乗っていますよね。 コンピ作りなどにテトラサイクリンを入れておらず、F'が抜け落ちたものを使用していて、 pQE-TriSystem-EGFPは非誘導状態でも高発現で毒性を示して、変異の入ったものしか取れてこない。 なんてことはありませんかね。 変異が入るのがプロモーターなどであれば、ORFのシークエンシングでは変異に気づきませんので、 他の大腸菌株で確認しないと分からないでしょう。

毒性があるのでは？ 削除/引用 No.194-12 - 2009/03/19 (木) 18:03:05 - ats 単に、目的のEGFP-proteinX融合タンパクが大腸菌でfoldingされない or 毒性があるのでは？ 毒性が強い場合は、正しいコンストラクトのplasmidを有する大腸菌はlac promoterのleaky expressionでも死滅する可能性があります（＝コロニーが取れない）。

本当に困っております 削除/引用 No.194-11 - 2009/03/18 (水) 06:09:00 - mmLabo みなさま誠にありがとうございます。 大腸菌で発現し、できれば将来同じコンストラクトで真核細胞で発現したいので、pQE-Triexpressionのplasmidを中心にやっております。 （できればマップを見ていただきたいところです。キアゲンThe QIAexpressionistを参照してください.page55） コンストラクトはCAG promoter, T5promoter, lac operator, ribosome binding site, Kozak, Stop codons, termination region、、、その他baculovirus発現用の配列が入ってます。シャインダルガノ配列も入っております。 EGFP, ECFP, EYFP, DsRed, Cherry,,,全てダメでした。（プレートにはIPTGを入れております。） 光源はEGFP用、フィルターはセットなので、最低でもEGFPはうまく行かねば なりません。ルミノアナライザーはありませんので、励起光が不足かもしれません。 Tsienの最初の論文(PNAS)はpGEXTからリプレッサーをはずし、ＧＦＰを入れたものを作り、そこから変異を導入して行ったと理解しております(どのような酵素を用いて、どの配列をどれくらい抜いたか、、、などの詳しい方法は論文には書いてありません)。リプレッサーをはずしてみましたが、XL1blueではダメでした。 そのほか、DsRedを見つけてきたロシアのグループが用いたpQEでも同様の結果でした（FEBS letters）。 過去の経験からligationはそれなりにうまく行っているはずであり、すでに手持ちの数種類のEGFPバリアントで、制限酵素を変えながら、色々試みてます。 クローンテックのEGFP（PT3078-5）はlac promoterですが、IPTGなしでも十分な蛍光です。EGFPに関しては、蛍光測定はきちんとしているはずです。 Westernなど、抗体を用いた検討はまだやっておりません。理由はEGFPによる発色はプレリミナリーなものだからです。将来のタンパクーEGFP発現、その後のスクリーニングなどの展開を考えますと、現段階で蛍光が出ないようでは、”話にならない”状況です。 自作plasmidでうまく行っている方、ぜひplasmid map等、お知らせください。 mmlabo@gmail.com あてにご連絡ください。共同研究などお願いできればありがたいです。

(無題) 削除/引用 No.194-10 - 2009/03/17 (火) 23:05:24 - ザンギ 何かの哺乳細胞用発現ベクターを増やそうと思ってリクローニングしたら、普通に（無駄に？）大腸菌コロニーが緑色してましたよ。 たまたまＳＤ配列ライクなのが入ってたんでしょうけども、ＧＦＰは安定性の高いタンパクだし、特に転写終結因子で挟んだりしてなければ周辺のプロモーターから転写されて、特に誘導かけなくても翻訳されてれば光ると思いますよ。 シャインダルガノ（ＳＤ）配列はつけてますか？

(無題) 削除/引用 No.194-9 - 2009/03/17 (火) 13:15:00 - 通りがかり 一年間も試行錯誤するくらいなら、確実に動くコンストラクトを人から貰った方がいいのでは？ Tsien lab の http://en.wikipedia.org/wiki/File:FPbeachTsien.jpg を作った人に連絡を取ってみるとか。

蛍光のある無しは何で判断していますか？ 削除/引用 No.194-8 - 2009/03/17 (火) 10:41:36 - ~ 既に多くの条件検討はされているのだと思います。 作ったコンストラクトをタンパク質発現用の大腸菌株に入れたことはありますか？ また、IPTG誘導などをかけたことはありますか？ SDS-PAGE→CBB染色でも発現は見れませんか？ 励起光は当てていますか？ FLA5000のようなルミノイメージアナライザーでも検出できないのですか？ コンストラクトが正しいものであるかどうかは、XL1-blue以外を使ってでも確認すべきだと思います。 pEGFPで光る以上は、やられている条件ではlac promoterで発現量は十分なのでしょう。 YFPなどをベクターからユニットごと切り出して、pEGFPのMCSに入れても発現しないのでしょうか。

大腸菌の問題ではないと思う 削除/引用 No.194-7 - 2009/03/17 (火) 07:58:32 - 通りがかり BL21 はプロテアーゼを欠損しているので蛋白が分解しにくいわけですが、特に合成量が多いわけではありません。GFP のような安定な蛋白なら、一般のクローニング用菌株で特に問題ないと思います。実際、先に挙げた pGLO のシステムでは HB101 を使うことになっています。 SD 配列などは正しく入れておられますか？

(無題) 削除/引用 No.194-6 - 2009/03/17 (火) 07:49:53 - ねむ タンパク質（EGFP）が発現しているのかどうか、と蛍光が見えるかどうか、を切り分けたほうがよいかと。まずは抗GFP抗体なりで発現チェックをされては。

大腸菌でしょうか？ 削除/引用 No.194-5 - 2009/03/17 (火) 06:39:15 - mmLabo みなさま、コメントありがとうございます。 とりあえずの実験目的は「タンパクにGFPを付け、大腸菌における蛍光発色でタンパク量を推定しよう」というものです。今後、スクリーニングなど研究を展開したいため、できるだけXL1-blueなどの、組み換え用大腸菌で、発色に成功したいところです。 「まずは簡単なものを」ということで、EGFP等ではじめた次第です。 いままで１年間、多数のコンストラクト（数十）を作りましたが、 「これは確実に発現」と言い切れるのは、作製したものにはありません。 唯一うまく行ったのは、クローンテックのEGFP（PT3078-5）のみです。 大腸菌はXL1-blueです。 真核細胞で発現した時は、「たまにうまくいかない」程度でしたから、相当厳しい状況です。 できれば、上記条件 1. XL1-blue 2. できればCFY, YFPなども発色 というのが、望ましいところです。 もしかしたら、基本的なベクター設計が間違っているのかもしれません。 真核細胞発現ではプロモーター、遺伝子、ポリＡだけで基本的に発現できると思いますが、大腸菌ではどうなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.194-4 - 2009/03/16 (月) 02:19:03 - 緑 目的は何ですか？ 私も自作ですがきちんと発現しコロニーが自然光下でも緑に光ります。普通のラクトースオペロンプロモーターでもオペレーターを除去するかリプレッサーのない宿主に入れると構成的に発現します。真核と原核で多少コドン使用の違いはあるものの問題なしです。 詳しくはこの方に尋ねるとよいかと思います。 http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/tsien.html

(無題) 削除/引用 No.194-3 - 2009/03/15 (日) 14:39:42 - 通りがかり pET と同様の T7 promoter を利用した自作ベクターで発現を確認しています。大腸菌は BL21(DE3) です。UV 照射下のコロニーはもちろん、大量培養してペレットにすると普通の室内光でも肉眼で黄緑色に見えますよ。入れている遺伝子は EGFP（クロンテックが売り出した最初のバージョン）にタグを付加したものです。誘導は必要ですが、最初から IPTG 入りのプレートで培養すればいいだけです。 高校での授業向けに pGLO (BioRad) というベクターも発売されているようですから、入手できるかどうか調べてみては？

どのくらいの発現量が必要なのでしょうか。 削除/引用 No.194-2 - 2009/03/15 (日) 14:38:24 - ~ 最適というだけの条件検討はしたことがありませんが。 昔のラボでpETで融合タンパク質を入れたときは、発現誘導をかけなくても、プレートに励起光を当てたら緑に光っているコロニーが見れました。 IPTGを塗ったプレートでは、励起光のランプをあてなくても、蛍光灯(か窓から入ってきた太陽光？)でコロニーが緑色に見えました。 その位の発現量は、pQEなどでも出ていると思いますが、 それでも不足しているのですか？ もし、肉眼で見るよりも感度の悪い測定系を使っているのでしたら、 検出系を改良したほうが早いと思います。

大腸菌でＥＧＦＰ 削除/引用 No.194-1 - 2009/03/15 (日) 14:09:57 - mmLabo 大腸菌でＥＧＦＰおよびその関連タンパクを発現させ、 コロニーの蛍光で同定しようと努力してます。 いろいろと試しましたが、最適な発現ベクターと方法（例えば発現誘導など）を教えてください。できるだけ誘導なしで、十分な蛍光がほしいです。 ちなみにpBluescriptはダメでした。 その他、 pGEX, pQE, pQE-TriSystemでは十分な蛍光を得られませんでした。

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