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(無題) 削除/引用 No.1938-22 - 2010/01/23 (土) 17:39:19 - POM RNeasy Micro Kitも候補の一つですね。 うまくいかなかったらボスにおねだりしてみます。 いろいろな意見を参考にさせていただいてもう一度やってみました。ペレットは以前より見えるようになった気がしますが、NanoDropではうまく測定できませんでした。とりあえずRTだけしてみて、PCRの結果が出ればまた報告させていただきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1938-19 - 2010/01/23 (土) 01:41:21 - あ 私ならシリカ系のカラムをお勧めします。 昔の先生などは古典的なフェノクロやエタ沈を盲信している人も多いですが、シリカカラムが純度・回収率・簡便さのいずれも勝っていると思います。 RNeasyを使用されたようですが、RNeasy Micro Kitを使用しましたか？数百個の細胞ならば余裕でRT-PCRができるはずですよ。

(無題) 削除/引用 No.1938-18 - 2010/01/21 (木) 08:14:00 - う ＞リンスのエタノールは初めは普通に70%でやって、浮いてきたら100%のエタノールを加えればいいという話だったはず。 まず、やったことない情報もないことを言うものじゃない。 エタノール沈殿のように手軽に見える実験と、一見難易度が高そうな実験、 手軽に見える実験では簡単に、こうやっていいのではと思いがちであるが、 どちらもちゃんと計算されている方法だということを考えた方がいい。 質問者の、どうしてもペレットが浮いてくるということだが、 初心者のうちは、そうなりがちなのは誰でも。 どうやったらうまくうまくいくか、人それぞれにコツを掴んでいるはず。 そのコツも人それぞれ。 まずは、そのコツを自分で掴むように実験してみることが肝心かと。 私は、液量が多いと液を抜いている時にペレットが浮きやすいと思うので、 ちょっと抜いて更に遠心、そしてまた抜くと注意深くやってみたりする。 まぁ、最近はそれもしなくてもいけるが、それはどうしてかよくわからん。 経験としか。

(無題) 削除/引用 No.1938-17 - 2010/01/20 (水) 19:18:35 - AP >リンスのエタノールは初めは普通に70%でやって、浮いてきたら100%のエタノールを加えればいいという話だったはず。 塩を含んだ70% EtOHが残っているうちに、EtOH濃度を高めることによって塩の溶解度が下がって析出することになりませんか。アルコール濃度と塩によっては溶解度がほとんどゼロということもあるわけで、液量を増やせばOKというのは楽観的すぎると思います（じゃ、いったいどのくらい増やせばいいのかも情報がないし）。まあ、多少のコンタミはプラクティカルには問題ならないので気にすることないという考えもあるでしょうが、スジをいうならそういうことです。 EtOH沈殿のとき、EtOHの終濃度を65%〜75%にするというのは、いろいろと意味のあることだと信じていますが。たとえば、DNAの場合だとコンフォメーションの維持に水和水/結晶水が重要ですが、アルコール濃度が高くなると高度に脱水され、80%前後で相転移(B型からA型へ）あったり、Tmが最低になったり、変性しやすくなったり、ということがあります。

(無題) 削除/引用 No.1938-16 - 2010/01/20 (水) 17:22:21 - ばいや リンスのエタノールは初めは普通に70%でやって、浮いてきたら100%のエタノールを加えればいいという話だったはず。 それにエタノール濃度を高めても液量を多くすると大丈夫なのでは？ ただ、それで沈殿がタイトになるのかどうかは知りません。やったことないので。

(無題) 削除/引用 No.1938-15 - 2010/01/20 (水) 14:24:27 - う まぁ、揚げ足をとるつもりは無いですが、 目に見えないペレットを、作業中に失ったから、 最終的に回収できなかったのか、そもそも、RNAが無かったのか。 これはどっちなのかということです。 それはともかく、目に見えるペレットでは 自分の手技ではどのように挙動するのか？ それをつぶさに観察して、こうやったらこうなる という方法を感覚として持ち、 そのようにして培った経験を目に見えないペレットに応用するればいいのでは？ ＞１0 ugもglycogenを入れていたら、沈殿が見えないとこはないと思いますが 私もそう思う。見えないから加えるのだろうに。 ＞リンスのEtOHの濃度を上げるのはおすすめできません。 私もそう思う。リンスの意味がなくなる。

(無題) 削除/引用 No.1938-14 - 2010/01/20 (水) 14:18:23 - AP 10 ugもglycogenを入れていたら、沈殿が見えないとこはないと思いますが。 微量の核酸をアルコール沈殿するときは、遠心時間を長く取るというのも（通常10分のところを30〜60分）基本的な手技だと思います。rinseのあとのrespinにしても、ペレットをテューブの底に再びしっかりとパックするのが目的で、それを達成するためなら時間はマニュアルどおりということにこだわることないでしょう。 リンスのEtOHの濃度を上げるのはおすすめできません。不純物を除去する目的ですので、高濃度のアルコールでは塩類など不純物が溶けなくなってしまうでしょう。 沈殿の乾燥は、自然乾燥で水滴が見えなくなるまで放置すればいいです。自然乾燥なら乾燥しすぎにはなりません。 微量の核酸の抽出では、チューブやチップなどへの吸着や、抽出のロスがクリティカルです。カラムでロスするのもこのためでしょう。ダウンストリームの実験が許すなら、早い段階（たとえばホモジナイズと同時）で、tRNAやpoly(dI-dC)などのキャリアーを入れておくと良いです。吸光度などでの収量の直接定量ができなくなってしまいますが（そもそも微量系だと正確な吸光度による測定は難しいと思いますが）、過剰量で投入したキャリアが抽出後、どれだけ回収されたかで抽出効率を割り出して、サンプル間の補正することもできましょう。

ペレットの扱い（細かいところですが・・・） 削除/引用 No.1938-13 - 2010/01/20 (水) 13:33:17 - POM 私もRNA easyが好きなので、最初はそれでTryしてみたのですが、サンプルロスが多いのか、GAPDHでRTをかけてもバンドが検出できませんでした。とりあえず、今後の汎用性もかねてTRIzolからやってみたいと思います。 ペレットは遠心・エタノール濃度などを工夫して再度チャレンジしてみたいと思いますが、ペレットが確認できないときは、みなさんどのような工夫をしていますか。僕は �@遠心時に、エッペンチューブの羽が外を向くようにセットする（ペレットが羽の下に集まることをイメージ） �Aエタノールを吸い取るときにチューブの羽の下の反対側から吸い取る。 ことにしています。デカントで捨てるだけにしている、とか、その辺の細かい手技で実践されていることがあれば教えていただけますでしょうか。 あと、見えないペレットを乾燥させるときは、時間をきめて乾燥されているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1938-12 - 2010/01/20 (水) 08:29:37 - ： ちょっとずつエタノールを除いていけばいいじゃない

(無題) 削除/引用 No.1938-11 - 2010/01/20 (水) 05:40:20 - おお トライゾールの場合微量になると、溶かすための水も少量にすると 思いますが、そうするとトライゾールの成分のコンタミが無視できなく なるようなきがします。それが230nmに来るのだと思いますが、 余裕があるのなら水にとかして(場合によってはDNaseI処理して) エタチンをもう一度した方がきれいになると思えます。 このスケールなら1ng-10ngの収量でしょうか、、、、、

ペレットの浮きやすさ 削除/引用 No.1938-10 - 2010/01/20 (水) 00:38:25 - 笑い男 　ペレットの浮きやすさは使用しているチューブのメーカーによって変わるはずです。たしかエッペンは浮きやすいとどこかに記載していたような・・（自信なし。ただ、どこかのメーカーのチューブでは浮きやすい（剥がれやすい）と書いていた記憶があります。） 　遠心のＧは沈殿させる為なので、強くしても問題ないと思います。（遠心しすぎてペレットが溶けにくいとかあるのかな？大量の沈殿なら起こりうるかもしれませんが、微量なら影響ないように思います。ただし経験も根拠もありません、スペキュレーションです。 　一応ですが、私なら１０００個ならカラムよりフェノール含有試薬を使ううなー。カラムって細胞数によって収量が変化しやすいし（メンブレンというのかフィルターっていうのか解りませんが、一定の結合容量を持つフィルターに対して少なかったり（今回のように1000個とか）逆に多すぎるとかの場合は使い勝手が悪いでしょ、自由度が低くて。フェノール含有の試薬なら、自由にスケールを変えられるので目的に応じて便利に使える印象を持っています。→１０００個ぐらいから抽出したいなら、それに応じてフェノール試薬の量も減らせば良いわけで！ 　共沈剤を使ってフェノール試薬を使えば、1000個ぐらい問題ないですよ！（これは経験ありの話です）あと、ペレットは見えない方が当たり前！と考えてもいいのでは？共沈剤無しでペレットが見えるぐらいに沈殿するなんて、十分すぎるぐらい核酸があるってことでしょ！という主義です。（もちろん定量的に再現性が得られる実験をしたい時に沈殿が見えないと、アルコール沈殿によるロスという不安を除去しきれないですが・・・えへェ・・

(無題) 削除/引用 No.1938-9 - 2010/01/19 (火) 18:53:42 - R >1000個だとRNeasyなどでとった方が良いと思います 理由としてRNAの純度や回収率が大きいです 私だったら逆にカラムを使うのものは、純度や回収率の点から避けます。 ペレットについては見えなくても全く気にしません。 見えてるときに剥がれたら吸えるだけ吸って、もう一度遠心しています。

少し高くなりますが 削除/引用 No.1938-8 - 2010/01/19 (火) 17:13:43 - さとし 1000個だとRNeasyなどでとった方が良いと思います 理由としてRNAの純度や回収率が大きいです

タイミング外してごめん 削除/引用 No.1938-7 - 2010/01/19 (火) 11:58:56 - ema 10ulH20で溶解して1ulを品質検査にまわして残り全量RTへ。 invtrogen SuperScriptIIでだいたいやっています。

取り説には 削除/引用 No.1938-6 - 2010/01/19 (火) 11:55:28 - ema LMD、ソート細胞で同様の操作をしてます。 ＞イソプロ沈後の遠心 って、７５％のとこだよね。ここは取り説には５分って書いてある 今、手元で取り説見てるけど 下の注意書きに102-104の少量のときにはGlycogen入れたり、遠心は３０−６０分にのばしてねってちゃんと書いてあるんだけど。 あ、共沈剤はエタ沈メイト使ってます。（いれるのはイソプロのとこから）ペレット見えて、いままで浮いてきたことないです。 O.D.はこの細胞数だと結構ウソかも。nanodropですが、一見有るように見えますが230あたりの値も大きいし、その後カラムにかけると、さっくりngオーダーギリギリすぎる結果に。 量は少なくともあるはずなのでそのまますすめるか、pico単位の計測器にかけるかかな。（Agilent2100Bioanalyzer高いけどやってます)

ありがとうございます 削除/引用 No.1938-5 - 2010/01/19 (火) 11:48:59 - POM 皆様ありがとうございます。 すいません。イソプロ沈は12000g, 10分で、聞きたかったのは、エタノール洗浄後の遠心が7500g以上、5分のところを12000gぐらいにあげてよいかということでしたが、別に問題ないようですね。 エタノール濃度が高いほどペレットがタイトになるのですね。今は75％でやっていますが、うまく取れてこない場合は99.5%のものを追加したいと思います。 実際の吸光度はナノドロップで測定しましたが、10^2,3,4,5の細胞からのRNAを100ulで溶解しましたが、波長がきれいではなく、うまく測れている気があまりしません。ちなみに私もキャリアーとしてｸﾞﾘｺｹﾞﾝ10ugを添加しています。 けんさんは実際にRTに成功されているということですが、実際に吸光度を測定されているのですか？もしよろしければ、その辺を詳しくお聞きしたいのですが、RTに用いるRNA溶液はどの程度の量のDWで溶解されているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1938-4 - 2010/01/19 (火) 00:35:48 - Boston わたしはキャリアとして、Glycogen (Invitrogen) を使用しています。

(無題) 削除/引用 No.1938-3 - 2010/01/18 (月) 23:22:53 - おお 遠心力は遠心機のマックス(近く)まで上げてかまわないです 1.5mlエッペンとかで使う遠心機であれば10000g以上出せます よね。これは遠心機のキャパによってくるので、96ウェル型の 物とか使っている場合そこまで出せない場合があるので お示しの遠心の設定はそういう物に対してのものでは ないでしょうか? あとキャリアーを使うとペレットが見やすくなると思います。 お示しの細胞数だとピュアーなRNAだと収量を考えると見えなくて 当然のようなきがします。 あと、70%のアルコールで洗う時無理せずにペレットが浮きそうに なったら取るのをやめて、その後100%エタノール(実際エタノールは95%くらいの 試薬を使うと思いますがそれでOK))を加えもう一度遠心すると ペレットがタイトになりますのでやりやすいです。 70%アルコールも若干濃いめ75%ぐらいに持ち上げてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1938-2 - 2010/01/18 (月) 22:48:28 - けん >最近少数細胞（500から1000個）からのRNA抽出にチャレンジしています。 >TRIzolの微量組織（細胞）からの抽出を参考にしておりますが、やはり、イソプロ沈をして、75%エタノールで洗浄後、ペレットが肉眼でほとんど確認できません。 これだけの細胞数でペレットが見える方が不思議です。 >わずかに確認できる時もあるのですが、エタノールを吸い取っている間にペレットがどうしても浮いてしまい、うまく上清を吸い取ることに苦労しています。 実際にRNAの吸光度を測定されています？ 私も同様の数からRNA抽出して（もちろんペレットは見えません）、DWに溶解したものの幾分かをRTしています。成功しています。 >この解決法として、 >�@洗浄するエタノールの量を減らしてペレットを吸い取る時間を短縮（プロトコルでは1ml→200ul程度） これは私は賛成です。私も200 ul EtOHで洗っています。 �Aイソプロ沈後の遠心を普段は4℃、7500g、5分で行っているところを12000-15000gにあげる ことを検討しているのですが、 トリゾールの使用法に本当にイソプロチンを5 minで行えと書かれてあります？ 私は4℃, 30 min, max speedでイソプロチンしています。

RNAペレットの遠心 削除/引用 No.1938-1 - 2010/01/18 (月) 22:38:41 - POM こんにちは。いつもお世話になっています。 最近少数細胞（500から1000個）からのRNA抽出にチャレンジしています。 TRIzolの微量組織（細胞）からの抽出を参考にしておりますが、やはり、イソプロ沈をして、75%エタノールで洗浄後、ペレットが肉眼でほとんど確認できません。わずかに確認できる時もあるのですが、エタノールを吸い取っている間にペレットがどうしても浮いてしまい、うまく上清を吸い取ることに苦労しています。この解決法として、 �@洗浄するエタノールの量を減らしてペレットを吸い取る時間を短縮（プロトコルでは1ml→200ul程度） �Aイソプロ沈後の遠心を普段は4℃、7500g、5分で行っているところを12000-15000gにあげる ことを検討しているのですが、上記2点で何か問題が生じえるでしょうか。 もし、同様に少数細胞からのRNA抽出をしている方がいらっしゃればアドバイスいただけたら幸いです。よろしくお願いします。

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