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組織切片で菌の取り込みを見たいのですが・・・ トピック削除
No.1936-TOPIC - 2010/01/18 (月) 19:29:23 - dino


私は研究室でプロバイオティクス菌について研究しています。


蛍光を持たせた乳酸菌をマウスに投与し、一定時間後（いつもは３時間程度）のパイエル板や盲腸パッチなどのリンパ組織へ取り込まれるかどうか確認したいのですが、クリオスタットでうまく組織切片が作れません。

具体的には、組織表面にいる菌が切片を作成する過程で組織の上に乗ってしまい、菌が取り込まれているのか判別するのが非常に困難です。

こういった研究はあまり論文を探しても見つからず、何度も繰り返しているのですがなかなか改善されません。

もしこのことに関する知識を持っている方がいましたらどんな些細なことでも結構ですのでアドバイスいただけないでしょうか。よろしくお願いします。
　
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みなさん回答ありがとうございます 削除/引用
No.1936-7 - 2010/01/20 (水) 11:26:30 - dino
CJさん、emaさん

回答ありがとうございます。
残念ながら通常の蛍光顕微鏡しかないので共焦点レーザー顕微鏡での観察は難しそうです。でも参考になりました。


組織さん

回答ありがとうございます．

>管腔内の細菌を捨ててもいいなら、サンプリング時に生食や固定液などで中を洗ってやれば、内容物を気にせずに薄切できると思います。

内容物を洗っても投与した菌が管腔に残っていて、今度はそれが切片作成時に溶けたOCT compoundと共に流れているのが見えました。洗いかたが足りないかもしれないので、次の実験ではかなり激しく洗ってみる予定です。

厚めに切って 削除/引用
No.1936-6 - 2010/01/20 (水) 10:28:18 - ema
機械があるかと、データ量がおもくなるのですが、もう少し厚めに切って、共焦点顕微鏡でZスタックで深度を変えてみれば、組織内に入っているものの判別ができると思います。

(無題) 削除/引用
No.1936-5 - 2010/01/19 (火) 18:05:59 - 組織
薄切する時に内容物が剥がれて、組織上にのってしまうということでしょうか？でしたら、やはり剥がれないように厚めに切るのがいいと思います。他の方からも助言がありますが、コンフォーカルで観察されているのなら、切片を厚くして、組織の中の方を観察視野に設定すれば、上にのった内容物は排除できるんじゃないでしょうか。

あとは管腔内の細菌を捨ててもいいなら、サンプリング時に生食や固定液などで中を洗ってやれば、内容物を気にせずに薄切できると思います。

(無題) 削除/引用
No.1936-4 - 2010/01/19 (火) 16:41:13 - CJ
なるほど、要するに消化管の内腔にある細菌と、消化管内部組織にあるそれとを区別したい、という話なのですか。
もし細菌が細胞内に取り込まれているなら、細胞マーカーで染めた上で共焦点レーザー顕微鏡でズームをかけて観察すれば細胞の内外にいるかは判定できますね。

(無題) 削除/引用
No.1936-3 - 2010/01/19 (火) 15:53:23 - dino
回答ありがとうございます。


>組織は固定してますか？
しています。4%PFAで一晩、その後スクロース溶液に置換しています。

>消化管なら10-15 umくらいでもいいんじゃないでしょうか
いつもは5 μmで切っていました。試してみます。

>状況がよくわからないので、もう少し詳しく説明して下さい。
文章ではなかなか説明しずらいのですが、顕微鏡で観察したときに消化管内容物が組織と重なって見えてしまうのです。そうすると内容物中の菌も組織と重なって見えてしまい、本当に取り込まれた菌なのかそれともただ単に重なってしまった内容物中の菌なのかが判別できないのです。

説明が下手ですみません。

(無題) 削除/引用
No.1936-2 - 2010/01/19 (火) 12:37:50 - 組織
組織は固定してますか？生体内での局在をできるだけ保存したいのであれば、やや強めに固定した方が良いように思います。ただラベルの性質と検出法にもよるでしょうけど。それと薄切の技術的な問題もあるかもしれません。切片を少し厚めにしたほうが安定して切れます。消化管なら10-15 umくらいでもいいんじゃないでしょうか。あとはクリオスタットの温度ですが、あまり低すぎるとパサパサになって切りにくくなります。クリオスタットの薄切法については過去にたくさんトピックがあるので参考にして下さい。

>組織表面にいる菌が切片を作成する過程で組織の上に乗ってしまい
状況がよくわからないので、もう少し詳しく説明して下さい。

組織切片で菌の取り込みを見たいのですが・・・ 削除/引用
No.1936-1 - 2010/01/18 (月) 19:29:23 - dino


私は研究室でプロバイオティクス菌について研究しています。


蛍光を持たせた乳酸菌をマウスに投与し、一定時間後（いつもは３時間程度）のパイエル板や盲腸パッチなどのリンパ組織へ取り込まれるかどうか確認したいのですが、クリオスタットでうまく組織切片が作れません。

具体的には、組織表面にいる菌が切片を作成する過程で組織の上に乗ってしまい、菌が取り込まれているのか判別するのが非常に困難です。

こういった研究はあまり論文を探しても見つからず、何度も繰り返しているのですがなかなか改善されません。

もしこのことに関する知識を持っている方がいましたらどんな些細なことでも結構ですのでアドバイスいただけないでしょうか。よろしくお願いします。
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