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(無題) 削除/引用 No.1933-6 - 2010/01/18 (月) 12:59:18 - おお >[Re:4] やまさんは書きました : > どれくらいの断片にDNAを切断するかによって違うと思いますが > 大体は500-1000ぐらいに切るので、 > これぐらいの長さがあったら70℃で加熱しても一本鎖になりにくいのでは？ あっそうか温度はそんなに高くないですね。 > > （どうでも良いですが、ChipよりChIPの方が一般的な表記だと思います。） 了解しました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1933-5 - 2010/01/18 (月) 12:57:14 - おお >[Re:2] TK−１さんは書きました : > > でこの時ターゲットのタンパクが2本鎖の両者にタッチしてない場合、一方の鎖は外れてしまいます。 > 何をイメージしておっしゃているのかはっきりわかりません。 例えば大腸菌のアルカリライシス法で、プラスミドも変性するはずですが プラスミドはサイズがゲノムに比べるとサイズが小さく両方の鎖が 完全に分かれないで、つなぎ止められているので再度適切にアニール しやすいですよね。 ターゲットのタンパクが+/-両方のさにブリッジしていれば、変性しても アニールしやすいはずです。 たとえばゲノムをフラグメント化して変性した後 そのまま室温でDNAを扱った場合、どの程度てきせつにDNAが正しく 2本鎖になるかというと、きっとパーフェクトジャないだろうと 思うわけです。じゃあIPで0.1%のDNAが回収できたとしてこれでも 大腸菌のゲノムのサイズに相当する複雑性があります。 これが変性されるわけですから、+/-の鎖がバラバラになった場合 ちゃんと本に戻れるのかなという疑問です。 もしターゲットのタンパクがブリッジしていたらアニールしやすいだろうと、、、、 まてよ、クロスリンク外すからブリッジしてても一緒か、、、、 とにかくちゃんと元の2本鎖にどの程度なっているのか、どの程度 対処できるのかって思ったわけです。

(無題) 削除/引用 No.1933-4 - 2010/01/18 (月) 12:52:08 - やま どれくらいの断片にDNAを切断するかによって違うと思いますが 大体は500-1000ぐらいに切るので、 これぐらいの長さがあったら70℃で加熱しても一本鎖になりにくいのでは？ と思います。 また、加熱後の戻りも早いのではないでしょうか？ ライブラリーを作る場合でも、プロテアーゼ処理やエタ沈等は行うと思いますので、何かに邪魔されて二本鎖を作りづらいとかはあまり考えられてないと思います。 （どうでも良いですが、ChipよりChIPの方が一般的な表記だと思います。）

(無題) 削除/引用 No.1933-2 - 2010/01/18 (月) 12:22:13 - TK−１ > でこの時ターゲットのタンパクが2本鎖の両者にタッチしてない場合、一方の鎖は外れてしまいます。 何をイメージしておっしゃているのかはっきりわかりません。 > クルードな条件ではそう簡単に2本鎖に戻らないようなき がします。 数百ベース程度のフラグメントならすんなり戻りそうな気がしますが。

Chipについて 削除/引用 No.1933-1 - 2010/01/18 (月) 11:22:11 - おお Chipを良くやっている人にお伺いします。 フォルムアルデヒドなどでクロスリンクしてクロマチンをIPする方法ですが、 IP後過熱し、クロスリンクを解く操作があります。確か70度ぐらいで2-3時間 からオーバーナイトというのがプロトコールに見受けられます。 でこの時ターゲットのタンパクが2本鎖の両者にタッチしてない場合、一方の鎖 は外れてしまいます。クルードな条件ではそう簡単に2本鎖に戻らないようなき がします。 そくPCRなら何ら問題ないと思いますが、そこからライブラリーを作る時、ポリメラーぜで末端を整えたりする時、ばあいによっては可也のものが脱落するのではないかとおもえます。 なにかそのようなことでご存じのことがありましたら教えてください。

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