BioTechnicalフォーラム [ウェスタンのゲル作成]

ファルコンチューブでゲルを調製すると、混ぜやすいので割と綺麗に作れますよ。
TEMDまで試薬を入れてしまって、ふたを閉めて、２～３回穏やかに転倒混和して、APSを入れてからまた転倒混和してゲル板に流し込みます。このときに泡が出来ても、上に浮いているものであれば、EtOHやブタノールでゲルを空気から遮断するときに消えてくれます。

後は、ゲル板を綺麗にしておくとか？シリコナイズをするとか？

ムラ…。
ラージゲルなら、一晩ゲルを放って置くのも有効です。後、スタッキングゲルとランニングゲルのpHの違いも案外重要ですよね。前に共同ストックのpH6.8のTris-HClのストックにpH8.0 Tris-HClが入っていたときに、確かに泳動はムラになった。犯人は未だ捜索中…。

(無題)

削除/引用

No.193-15 - 2009/03/16 (月) 13:59:35 - 通りすがり

私も脱気は不要だと思います。
ここら辺のページも参考になるかもしれません。
http://www.gelifesciences.co.jp/technologies/ettan_dige/dojo05_02.asp

どの操作で気泡が入るかによっても対処法が変わると思いますが･･･
質問者さんの書き込みからでは、SDS-PAGEゲルの作成過程なのか、
メンブレンへの転写過程なのかがわかりにくいです。

(無題)

削除/引用

No.193-14 - 2009/03/16 (月) 10:33:58 - ｐｐｐ

ブロッティング時に、ゲルに均一に電圧がかかっておらず、
そのため均一にトランスファーされていないだけでは？
そのようなケースでは、トラスファーされた蛋白量のムラは
もちろんのこと、泳動にムラができているように見えますよ。
まずはブロッティング前にクーマシーで染めてみては？

(無題)

削除/引用

No.193-13 - 2009/03/15 (日) 20:38:24 - A

ミニゲルで頻繁にWBしますが私も脱気してないですね。以前したほうが
良いと聞いたことはありますが特にしなくとも問題が無いので。それよりも
ブロット時の気泡の方が時々トラブルになります。

(無題)

削除/引用

No.193-12 - 2009/03/15 (日) 19:51:20 - Pumpkin

私は脱気なしで問題ありません。ミニゲルでもシークエンスゲルのような大きいものでもです（用途はシークエンスでないですが）。アクリルアミドゲル溶液、DDW、Trsi-Cl(pH8.8)、SDS溶液、APS溶液をコニカルチューブにとって転倒混和。TEMEDをいれて転倒混和で直ぐにゲル板に流し込んでいます。SDSの泡が出来ても、チューブのヘリをガラス板にあてなが入れれば泡は入らないし、たとえ下のほうや途中に入ってもトントンして上に上げておけば、水飽和ブタノールを添加したときに消泡されます。

皆さんが書かれているように、試薬が古すぎるのはよくありません。昔は試薬がよくなかったから脱気したと聞いたことがあります。APSは新鮮なものをつかうこと、なんてよく実験書にかいてあります（新鮮なものは水に溶かすとパチパチなります）。僕は10%溶液を小分けにして－20℃保存で、使いきりしています（そこまで慎重でなくて全然大丈夫ですが）。

ちなみに、ゲル作りに運任せなんて絶対にありません。ちゃんと作れます。

(無題)

削除/引用

No.193-11 - 2009/03/15 (日) 15:09:28 - K

ミニゲルのときは脱気してもしなくてもうまくいっていますが、ラージゲルのときは脱気したほうがきれいにできてます。TEMED,APSを入れる前に脱気しています。
他の人に聞くと｢必要ない」とも言われますが。

～さんが書かれているように、固まりかけのゲルを流しているのかも知れませんね。それと、アクリルアミド、SDSの溶液はあまり古いものを使用すると固まり方にムラができるとききました。

(無題)

削除/引用

No.193-10 - 2009/03/15 (日) 13:54:34 - ami

脱気なし、APS/TEMED入れたらその後は混ぜすぎない(小さな気泡ができるのを防ぐ？)って感じで気泡できませんしムラも経験しません。

(無題)

削除/引用

No.193-9 - 2009/03/15 (日) 13:13:12 - yama-san

お邪魔してすみません。

ぼくは、ＳＤＳとAPSとTEMEDを入れる前に脱気してます。
脱気方法がみなさんとちがうのかもしれませんが、
ＳＤＳをいれるとアワアワになってしまうからです。
この方法でもゲルはうまく作れました。

ただ、以前、使っていたアクリルアミドが古くて、ゲルがうまくできないことがありました。
アクリルアミドの消費期限とか、ストックをつくってからかなり時間がたっていたりすることはないでしょうか？

(無題)

削除/引用

No.193-8 - 2009/03/15 (日) 13:06:16 - 00

お邪魔しますが、皆さん「脱気」してらっしゃしゃるんですか？
した事がないのでわからないのですが、しなくてもきれいなゲルってできませんか？

APS、TEMED以外をビーカーやファルコンチューブ内で良く混合し、その後に混ぜつつAPS、TEMED投入、でさらに5-10秒位撹拌して、カセットに注ぎ入れる。で、軽く何度か「トントン」ってカセットを実験台で叩く。水を重層する。

この作り方で困った事がないのですが、いかがでしょうか？

それと、過去のトピックから参考にさせて頂きましたが、SDS抜きでゲルを作ってみては？
これならかなり強めに撹拌しても泡立ちにくいでしょうから。

(無題)

削除/引用

No.193-7 - 2009/03/15 (日) 12:52:04 - てん

何度もありがとうございます！脱気後にAPS,TEMEDをいれて作ってみます。

(無題)

削除/引用

No.193-6 - 2009/03/15 (日) 12:44:15 - ~

その方法を教えてくれた人と一緒に作ったことは無いのですか？

TEMEDを入れてから脱気しているのであれば、
すでに固まり始めているものを流し込んでいるために、ムラができている可能性は高いと思います。
もしかしたら、教えてくれた人は手際が良いために固まる前に流し込むことが出来て、
あなたはまだそこまですばやく出来ていないのかもしれません。

また、泡については、固まりかけで粘性が高くなっているために、流し込むときに入ってしまった泡が抜けないのかもしれません。
教えてくれた人は泡が入り込まないようにうまく流し込めるのかもしれません。

一度、APS,TEMEDを入れる前に脱気して、
脱気後でAPS,TEMEDを入れてみてはいかがでしょうか。

(無題)

削除/引用

No.193-5 - 2009/03/15 (日) 12:43:04 - てん

以前やっていた人たちに聞いているのですが、皆さん結構運頼み的なことをゆわれるので・・・。
攪拌をもう少ししっかりやってみます。どうもありがとうございます。

ラボで作れる人はいないのですか？

削除/引用

No.193-4 - 2009/03/15 (日) 12:35:00 - ~

ゲルだとしたら、
APS,TEMEDの添加後の攪拌が不足しているのかもしれませんし、
添加後に時間をおきすぎて、固まりかけを入れてしまっているのかもしれません。

所属している大学、研究所などにゲルをきれいに作れる人はいませんか？
ラボで新しく系を立ち上げるのでしたら、出来る人に教わりに行くことをお勧めします。

(無題)

削除/引用

No.193-3 - 2009/03/15 (日) 12:32:55 - てん

脱気は3分ぐらいしていますが、やはりTEMEDはいれずに脱気した方がよいのでしょうか？私が教わった方法ではすべて混ぜてから脱気しているのですが。
それから泳動時にきれいに流れずにムラができているときがあるのですが。

(無題)

削除/引用

No.193-2 - 2009/03/15 (日) 12:22:20 - K

ウェスタン、というかSDS-PAGEのゲルですよね。
ゲルを作る前に溶液を脱気されてますか？
サンプルを流すとムラが、というのはゲルのほうでしょうか、メンブレンのほうでしょうか。メンブレンのほうでしたらゲル以外にも検討する点は出てきます。

ウェスタンのゲル作成

削除/引用

No.193-1 - 2009/03/15 (日) 11:50:30 - てん

全19件 ( 1 ～ 19 )　前 | 次　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を