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(無題) 削除/引用 No.1917-4 - 2010/01/16 (土) 13:16:38 - ｙｔ 一つ確認したいのは、その標識蛋白は「全く発現されなかった」のでしょうか？ それとも、少しは発現してて濃縮したりすれば一応は認められるレベルなのでしょうか？ それと、その蛋白の性質や翻訳後修飾や局在を含めた挙動は既によく調べられているのでしょうか？ 　 もしも、「濃縮しても全く認められない」と言うのであれば、コザック配列だけでそこまで発現効率が落ちるのか疑問に思いますがどうなのでしょうか？ もう一つ可能性として考えたのは、Ｃ末が翻訳後修飾で切り取られてタグが切り離されてしまうことですが、それでも翻訳中のものが少量検出されても良い気はしますので、違うかも知れません。

(無題) 削除/引用 No.1917-3 - 2010/01/16 (土) 08:50:12 - Boston 失礼を承知のうえでの質問ですが，目的遺伝子をクローニングした際、シーケンスで変異が入っていない事は確認されましたでしょうか？もしくは、短いエクソンが欠けてしまったスプライシングバリアントでフレームシフトが起きているとか． 1st ATG として、大抵 NcoI 配列を使っています。

(無題) 削除/引用 No.1917-2 - 2010/01/16 (土) 04:11:29 - おお ベクターによりけりでしょうけど、ATGから数ベース上流を余分に含めて ほりこむ事がたいていでしょうか、、、、

融合タンパクを作りたいのですが、教えてください。 削除/引用 No.1917-1 - 2010/01/15 (金) 14:43:23 - けん いつも拝見させていただいております。 ふとした疑問です。 現在、pcDNA-V5-Hisx6に目的の遺伝子をクローニングしました。 この遺伝子のC末にタグが来ます。 しかし、これをHEKに発現させても抗HIS抗体や抗V5抗体で検出されるはずのbandはwesternでは、でませんでした。 コドンやフレームはあっております。当然目的の遺伝子のSTOPコドンは抜いてます。 私はこれまでplasmidコンストラクションは数多くしてきたつもりです。 が、ひとつ初めてのものがあります。 それが今回のようなC末にタグが来るようなコンストラクションです。 ここで皆様にお聞きしたいのは、目的の遺伝子をタグのN末に挿入したい場合、ATGから始まる目的遺伝子を融合させるのではなく、ATG周辺を理想的なコザック配列になるようにしたものを入れますでしょうか？ おそらくコザック配列にしなかったのが原因にように思います。 みなさんならどういった塩基を挿入することで理想的なコザック配列にされますでしょうか？ 経験がおありでしたら教えていただけますと幸いです。

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