全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1913-11 - 2010/01/16 (土) 00:29:54 - ethics まずは、以前行われていたように、マウス脾臓B細胞を用いた刺激系を陽性コントロールとして検討されてはいかがでしょうか。刺激後、鏡検でHomotypic adhesionはみられますか？

(無題) 削除/引用 No.1913-10 - 2010/01/15 (金) 22:18:47 - 300万 ポスドクTさん ありがとうございます。RPMI1640＋10%自己血清でのLPSに対する反応は、生存率とFACSでの細胞の大きさしか見ていませんが、無血清培地の時とほぼ同じでした。少なくとも、T細胞をCon Aや抗CD3抗体等で刺激した時のような明らかな細胞サイズの増加や細胞数の増加は見られなかったので、3H-Thymidineの取り込み実験は行っていません。

(無題) 削除/引用 No.1913-9 - 2010/01/15 (金) 17:45:03 - ポスドクT なるほど、無血清培地を使用されていたのですね。 LPSの応答には血清中のタンパク質 （LBPがLPS認識に重要ですが、Soluble CD14も関わっているかもしれません。その他の因子の関与も否定できません。） が必須なので、無血清ではLPSへの応答性は格段に下がります。 もしも上記が原因であれば、 RPMI1640＋10%自己血清では応答性が認められるはずです。 同条件下での結果はどうだったのでしょうか？ ちなみに自分は10％FBS（非動化済）＋RPMI1640でB cellのLPS刺激を行って上手くいっています。

(無題) 削除/引用 No.1913-8 - 2010/01/15 (金) 16:59:52 - 300万 皆さん 様々なアドバイスありがとうございます．皆さんご丁寧にお答え頂けるので，調子に乗って，もう少し細かく説明いたします．宜しくお願いいたします． 先ず，B細胞マーカーですが，ラットの場合，CD45RAが一般的に使われているようで（B220≒CD45RA？），BD Pharmingenのサイトでもそのように扱われています．ミリテニーバイオテクのマグネットビーズでのB細胞マーカーとしてCD45RAが使われています．マウスのCD45RAとラットのCD45RAでは少し違うのかなという気がします．私もマウスの細胞を以前使用，少し混乱していますが，ラットではB220はありません．ラットではマウスに比べ細胞マーカーや活性化マーカーが限られているのが現実ですが，分けあってラットを使用しています． 次にLPS濃度ですが，0.1〜100μg/mLという常識外の濃度まで検討しましたが，ダメでした．生存率は2日間培養でいずれも80%弱で，FACSでFSCを見ても5〜10μg/mLで最も大きくなりますが，極わずかでした． 3H-Thymidineのカウントは，未刺激で1000cpm，LPS刺激で2000cpmくらいです（チミジンは1.85kBq/2.5x10^5cells/0.2mLで8時間）． 培地は一般的にはRPMI1640＋FBS（又は自己血清）かと思いますが，ウシ成分が活性化を起こすのを嫌って，AIM-VというGIBCOの無血清培地を使っています．これは元々ヒトのリンパ球用なのですが，ラットT細胞で問題なく使えたので，B細胞でも使ってみました．ポスドクTさんのコメントによれば，未刺激で100cpm程度（条件の違いもあると思いますが）との事なので，培地中のヒト成分がB細胞を刺激してしまっているのでしょうか？ このようなことも考え，RPMI1640＋10%FBS，RPMI1640＋10%自己血清（いずれも非働化）でLPS刺激をしてみました．そうすると，AIM-VとRPMI1640＋自己血清の場合，生存率は70〜80%で比較的高いのですが，FBSを血清にすると生存率は50%まで落ちました（ウシ成分によって活性化し，Apoptosisっぽい細胞が見られました）．一方で，細胞の大きさはFBSを入れたときは，AIM-V又は自己血清の時に比べ1.2〜1.3倍大きくなりました．ラット脾細胞でもダメでした．これはもう，今の実験系ではE.Coli O55:B5には反応しないのでしょうか？他の細菌株由来でも同じなのでしょうか？ ある文献で，マウスIgG抗体に対する抗Ig抗体のF(ab')2部分（whole IgGはダメ）でマウスB細胞を活性化できるとの情報がありました．この場合，Thymidineの取り込みは未刺激の<10倍以下なのですが，私のデータよりは取り込まれているので，そもそも活性化B細胞でのThymidine取り込みはこんなものなのかと思っていましたが，マウスではLPS刺激B細胞でThymidine取り込みが未刺激の100倍以上上がるというのが分かり良かったです． また，いろいろ検討してみます．

(無題) 削除/引用 No.1913-7 - 2010/01/15 (金) 10:25:50 - DC まず、CD45RAというのがB細胞マーカーになっていないんじゃないかと・・・ CD45RAだとT cellも入ってきますよね・・・？ それから、Thymidine uptake assayが未刺激B cellの増殖に対して2倍程度との事ですが、未刺激B cellの増殖（カウント）はどのくらいなのでしょうか。 FBSのロットによってはLPSを多く含んでいるものもありますし、コントロール自体の増殖が結構起こってしまっているなんて事はありませんか？ LPS濃度も1 ug/mlあれば十分活性化されると思いますし…

(無題) 削除/引用 No.1913-6 - 2010/01/15 (金) 09:56:03 - ポスドクT B6バックの脾臓B細胞をLPS（100ng/ml）で刺激すると、 細胞増殖および細胞表面分子（CD69,CD86他もろもろ）の発現上昇が容易に認められます。 増殖が3H-Thymidineの取り込みがコントロールの2倍というのは低すぎですね。自分が行う時には最低100倍以上（コントロール：100cpm程度、LPS刺激：10000cpm以上）にはなっています。ちなみに刺激後2.5〜3日の結果です。 LPS10μg/mlは一般的には使用しない濃度です。 Toleranceでもかかっちゃってるんですかね？

(無題) 削除/引用 No.1913-5 - 2010/01/14 (木) 23:59:57 - ゆーた B細胞のマーカーはCD45RAを使用されているのでしょうか？ CD19とかB220など一般的なマーカーではいけないのでしょうか？ 細胞が元々反応しないものなのかもしれないですね、私はsplenocyteをLPSで刺激して3H-thymidine uptakeを見てましたが数百倍にカウントが上がりました。

(無題) 削除/引用 No.1913-4 - 2010/01/14 (木) 22:45:01 - 300万 すみません。初めての投稿で途中で送信してしまいました。 （続きで）細胞の芽球化（FACS）、細胞数増加を観察していますが、未刺激細胞に比べ、チミジン取り込みは2倍程度、細胞の大きさ（芽球化を指標）は1.3倍程度、細胞数は変わりなし、です。活性化B細胞はCD80の発現が増加するとの事でanti-CD80 mAbを用いてFACSで確認しましたが、CD80の発現は見られませんでした。B細胞の確認はCD45RAで行っています。ちなみに、Con A刺激のT細胞はIL-2Rの発現増強がFACSで容易に観察され、細胞数の増加も鏡検で明らかで、チミジン取り込みも2日間培養で未刺激に対し100倍以上見られ、T細胞の増殖活性はうまくいっています。そこで質問ですが、LPSによるB細胞の活性化はこんなものでしょうか？。また、B細胞が活性化しているかどうかの証明はどのようにされていますか？（活性化の定義で違うと思いますが）

(無題) 削除/引用 No.1913-3 - 2010/01/14 (木) 22:37:47 - ゆーた 10マイクロg/mLの刺激とは随分と強力ですなあ。

(無題) 削除/引用 No.1913-2 - 2010/01/14 (木) 22:25:27 - 300万 ？？？

B細胞の活性化の確認 削除/引用 No.1913-1 - 2010/01/14 (木) 22:20:35 - 300万 いつも閲覧させて頂いております。B細胞を用いて実験されたご経験のある方にお聞きします。 論文で、B細胞をLPSで活性化し云々・・・という論文を良く見かけます。私もラット腸間膜リンパ節細胞をLPS（E.Coli 055:B5 10マイクロg/mL）を添加し、2日間の培養で実験に使用していますが、3H-Thymidineの取り込み、細胞の芽球化（FACS）、IL-2Rの

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---