全18件 ( 1 〜 18 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

遅いかもしれませんが・・・ 削除/引用 No.191-18 - 2009/08/07 (金) 11:44:10 - MOMO プレートに播種する前にトリプシンで浮かした状態の時にディッシュ内で細胞とウイルスを混合し、96ウェルプレートに播種してはいかがでしょうか。 ２つの操作を同時にほどこすため、細胞へのダメージ等がないかを確認したほうがよいとは思いますが… あと蛇足ですが、酵素活性（還元など）をもとに細胞数を計測する場合、自分の用いる試薬に還元作用がないか、また計測する吸光度に影響を与えないかを調べたほうがよいです。 私は以前、それで苦労しました。。

(無題) 削除/引用 No.191-17 - 2009/03/19 (木) 09:58:41 - R 読ませていただく限りでは、なぜ96-wellで難しいのか分かりません。 コストを気にされるなら96-wellで実験するのがいいのでは。

(無題) 削除/引用 No.191-16 - 2009/03/18 (水) 22:44:33 - ねこたろう IRESさん＊さん 癌細胞株にヘルペスウイルスを感染させる実験をしています。 ウイルス感染前にFCS入りの培地を吸引除去してPBS(-)で洗浄後、無血清培地にウイルスを入れて感染させてその後、FCS入りの培地を加えるというプロトコールです。コントロールとしてウイルスなし群をとってウイルス群/コントロール群で細胞数を比較しています。 論文等では24wellで10の４乗、96wellで10の3乗の細胞数で感染させています。プロメガのLDHアッセイ（cytotox96）やコールターカウンターやトリパンブルーでの計算をしているものもあります。celltiter96を使用しているものもありました。 今回、手計算はあきらめてプロメガのcelltiter96　aqueous　one　solution（MTS）でアッセイしようと思っています。取説にはB9　cellを5000/wellで96wellプレートに播いて測定する一例がかかれています。この条件でいけば24wellで500ul/wellくらいの量にすれば2x10の4乗くらいでも測定できると思っています。実際５分の１の薬液100ulで十分発色するのは確認しています。メーカーに問い合わせて吸光度1程度までならば細胞数と吸光度がリニアに対応するだろうとの返答でした。

(無題) 削除/引用 No.191-15 - 2009/03/18 (水) 20:21:44 - IRES >[Re:14] ＊さんは書きました : > ＞20000個/well（24well plate） > での濃度では、MTT系では評価は難しいと思います。事実上無理。 そうでもないですよ。MTTそのものでは難しいですがこちらのキットでは測定できています。ただ、24wellでは試薬の使用量が増えますが... 参考までに。 http://dominoweb.dojindo.co.jp/goodsr5.nsf/View_Display/CK04?OpenDocument

(無題) 削除/引用 No.191-14 - 2009/03/18 (水) 16:30:45 - ＊ ＞20000個/well（24well plate） での濃度では、MTT系では評価は難しいと思います。事実上無理。 そもそも、ウイルスの感染による細胞の効果を見たいと言う評価系と思うのですが、 そのような系で、その細胞濃度は普通あり得ないのではないでしょうか？ 何か特殊な事情があるのでしょうか？ 　 また、96穴でのウイルス感染はそれほど手間がかからず楽ではないかと思うのですが、 どのような点が不具合があると感じているのでしょうか？ 内容がよく見えませんので、可能であればもう少し突っ込んでお話しして頂ければ、すんなり解決する無いようだと思うのですけど。

(無題) 削除/引用 No.191-13 - 2009/03/18 (水) 11:19:02 - これ これ私も思いますけどね． 20000個（＋α）程度の細胞をプレートやエッペンでいじってたら細胞数のカウントは安定しないだろうと思います． 回収時の様子を見てもさほど増えてはなさそうですし… >[Re:10] 細胞数さんは書きました : > 細胞数算定までにどの程度増殖するのかわかりませんが、20000個/well（24well plate）という細胞の少なさが安定しない原因の一つではないかとも考えられました。 > > 細胞数算定時に予測される総細胞数はどの程度なのでしょうか？ > 細胞数が少なければ少ないほど各種操作におけるロスなどの影響が大きくなると思います。 > > 20000個/well（24well plate）という非常に少ない密度で蒔く必要はありますか？

(無題) 削除/引用 No.191-12 - 2009/03/16 (月) 19:21:32 - ねこたろう IRESさんありがとうございます。 やはり手計算は困難と考えて一液式のもの（WST-1やMTSの一部）を考えてみることにしました。

(無題) 削除/引用 No.191-11 - 2009/03/16 (月) 12:27:51 - IRES >[Re:7] ねこたろうさんは書きました : > IRESさんありがとうございます。 > > ウイルスによる増殖抑制および細胞破壊についての研究なので　 > ウイルス使用群での生細胞/コントロール群の生細胞という割合を求めています。IRESさんの方法ですると少し違った値になりそうなので手計算でのカウントかMTTでの値比較か、高価なので研究室にはないですがコールターカウンターを使うかの方法になりそうです。IRESさんの方法では少し複雑になりそうです。 リンクの内容を読まれましたか？ ディタージェントで全細胞を可溶化して全細胞のLDHを測定、死細胞から流出してきたLDHの値で死細胞/全細胞の比率を出せるようになっていますが... MTTを行うのであれば、若干原理は異なりますがDojindoのWST assayが簡便ですよ。リンクは張りませんので探してください。

(無題) 削除/引用 No.191-10 - 2009/03/16 (月) 02:32:42 - 細胞数 細胞数算定までにどの程度増殖するのかわかりませんが、20000個/well（24well plate）という細胞の少なさが安定しない原因の一つではないかとも考えられました。 細胞数算定時に予測される総細胞数はどの程度なのでしょうか？ 細胞数が少なければ少ないほど各種操作におけるロスなどの影響が大きくなると思います。 20000個/well（24well plate）という非常に少ない密度で蒔く必要はありますか？

(無題) 削除/引用 No.191-9 - 2009/03/15 (日) 23:25:53 - ぶりぶり >[Re:1] ねこたろうさんは書きました : > 吸引によって細胞が吸い込まれてしまうのかばらつきが大きくて困っています。 　吸引の影響を確認するために、遠心スピードをもう少し上げてペレットを吸い上げないように硬くしてみるのはダメでしょうか？ 　ウイルス無しのコントロールの成長はトリパンブルーカウントで安定していますか？ 　トリパンブルーなら生死も目視で確認できるので、２４well中にある全ての細胞（死んでる／生きてる／剥がれそう）を回収するのも一つの方法かなとも思いました。

(無題) 削除/引用 No.191-8 - 2009/03/15 (日) 23:15:07 - ami っ絶対数用ビーズ http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&entryPoint=adirect&productID=C36950&messageType=catProductDetail

(無題) 削除/引用 No.191-7 - 2009/03/15 (日) 20:51:01 - ねこたろう IRESさんありがとうございます。 ウイルスによる増殖抑制および細胞破壊についての研究なので　 ウイルス使用群での生細胞/コントロール群の生細胞という割合を求めています。IRESさんの方法ですると少し違った値になりそうなので手計算でのカウントかMTTでの値比較か、高価なので研究室にはないですがコールターカウンターを使うかの方法になりそうです。IRESさんの方法では少し複雑になりそうです。

(無題) 削除/引用 No.191-6 - 2009/03/15 (日) 14:49:20 - IRES 生細胞のLDHを測定するのではなくて、死細胞から培養液へ流出してきたLDHを測定するということです。 各社からキットが出ていて原理も大して変わりませんが私はロシュのものを使っています。以下を参照ください。 http://www.roche-biochem.jp/catalog/index.php/product_3.5.3.27.1.14/category_33070.html

(無題) 削除/引用 No.191-5 - 2009/03/15 (日) 12:10:14 - ねこたろう IRESさん、ありがとうございます。 LDHアッセイというとcytotox96などですか（Tritonx100　PBSで細胞を溶かして一部をとって薬液と混ぜてプレートリーダーにかけるものですね。）、コストも割合安いですね。しかし、LDHは半減期が長いのでPBS洗浄して死細胞を取り除かないとならないですね。このときウイルスの影響ではがれた生細胞・はがれかけた生細胞も同時に除去されてしまうのではないかと考えています。ウイルスの感染の手順からは96wellは使いにくいので24well以上の大きさのカルチャープレートを使用しています。そのためMTTやMTSはコストの問題でなかなか使いにくいのです。 96wellなどで１万個以内の細胞数を計算盤で測定することは可能でしょうか

(無題) 削除/引用 No.191-4 - 2009/03/15 (日) 11:34:12 - IRES トリパンブルーの系は簡便ですが、その測定方法から安定したデータを得るのは難しいと思います。ましてウイルス感染のステップもばらつきが生じやすいので難しいのではないでしょうか。ウイルス感染による細胞の生/死を見る為に私はLDH assayを用いて安定したデータを得ていますがいかがですか？

(無題) 削除/引用 No.191-3 - 2009/03/15 (日) 10:53:15 - ねこたろう ~さんありがとうございます。 ウイルスの効果でディッシュからはがれた細胞も含めて生細胞を測定したいので、できれば上清中の浮遊細胞も回収するためにこのプロトコールにしました。エッペンに回収して遠心して上清除去するときにロスが生じるのも考えられます。上清を吸引除去するのにはパスツールピペットを用いて100ulのトリパンブルーで再懸濁していますが他に良い方法はありますか？ やはり上清除去を伴うプロトコールは無理があるでしょうか。研究室にある血球計算盤では1xトリパンブルーで再懸濁しても10000/ml以上の濃度が必要なためこのようにしています。 論文では96wellプレートに細胞を播いてこれをトリプシン処理して回収し、トリパンブルー血球計算盤で測定しているものもあり、何か工夫があるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.191-2 - 2009/03/15 (日) 09:59:21 - ~ トリプシン処理後に、プレートを顕微鏡で見て、 細胞が残っていないことは確認していますか？ トリプシン処理後に、x2のトリパンブルーを等量入れて、 そのままカウントできませんか？ 計測中にダメージを受けるようでしたら、 ウシ血清も混ぜてみてはいかがでしょうか。

トリパンブルーでの生細胞数測定について 削除/引用 No.191-1 - 2009/03/14 (土) 20:57:46 - ねこたろう 24ウェルのカルチャープレートに20000個/wellで細胞を播いて24時間後にウイルスを感染させてその効果を測定しています。トリプシン処理した細胞を回収してトリパンブルーを用いて血球計算盤で細胞数を経時的に測定していますがなかなかうまくいきません。 現在、1.5mlのエッペンチューブに24ウェルから回収した培地と洗浄したPBS(-)とトリプシン処理した細胞懸濁液を回収して遠心後、上清除去してトリパンブルー100ulで再度懸濁して血球計算盤で測定しています。 吸引によって細胞が吸い込まれてしまうのかばらつきが大きくて困っています。 予算的に24wellプレートではMTT等のキットは使いにくいのと96wellではウイルス感染等が行いにくいので24ウェルでの計算盤を用いて培養細胞数測定をうまくされているかたおられましたら教えていただけませんでしょうか

全18件 ( 1 〜 18 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---