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(無題) 削除/引用 No.1907-5 - 2010/01/15 (金) 15:20:23 - あああ 感染させたウイルスゲノムもしくはトランスフェクションしたプラスミドと発現したmRNAは区別できているのでしょうか？ 2.5倍程度の差だとゲノムやプラスミドが残っているのと区別がしにくいとおもいますが。

(無題) 削除/引用 No.1907-4 - 2010/01/14 (木) 16:46:45 - ゆーた あんたそんなのも知らんでレトロウイルスなんて使っちゃだめよ 失格だよ

(無題) 削除/引用 No.1907-3 - 2010/01/14 (木) 14:44:52 - yw お返事ありがとうございます。 packaging cellに作らせたレトロウイルスを細胞にinfectionしました。 安定導入されています？一過性でしょうか？ わかりません。 すみませんが、何をもって安定か一過性と言えるのか教えていただけますと光栄です。

(無題) 削除/引用 No.1907-2 - 2010/01/14 (木) 14:22:08 - ゆーた うーんと、まず確認なんだけどpackaging cellに作らせたレトロウイルスをinfection（感染）させたんですよね？ それともレトロウイルス発現ベクターをそのままtransfectionした場合の話でしょうか？ 安定導入されています？一過性でしょうか？ Q1. 通常、stable transfectionは、そのトランスフェクションした細胞を培養している限り、その目的遺伝子は、コントロールよりも高い発現量を示すはずと考えていいのですよね？ そうとも限らないです。 iPS細胞樹立に使う４つの因子はreppressionされますし。 2.5倍は有意的なのか恣意的なのかは答えは出ないと思いますので、まずは再現性とtriplicateでやってみましょう。

retrovirus vectorを用いたtransfection 削除/引用 No.1907-1 - 2010/01/14 (木) 13:51:25 - yw Nolan labのpBMN vectorを用いて、細胞にtarget geneをトランスフェクションし、目的遺伝子を強制発現しました。 細胞播種後24時間後の目的遺伝子のmRNAの発現が、空のベクターを用いてトランスフェクションした細胞(コントロール)より2.5倍程、上がっているのをRT-PCRで確認しました。トランスフェクションする前から、目的遺伝子の発現が結構高かったので、2.5倍は、そんなに高くない値かもしれませんがトランスフェクションがうまくいったと判断し、この細胞系を使って、他の実験(mineralization assay) を始めました。(ただこのときサンプル数は1です、triplicateしていません） (ウェスタンも平行して行っていますが、まだプロテインレベルでの上昇は確認出来ていません） Q1. mineralization assayで、思うような結果が得られなかったため、質問をさせていただくのですが、通常、stable transfectionは、そのトランスフェクションした細胞を培養している限り、その目的遺伝子は、コントロールよりも高い発現量を示すはずと考えていいのですよね？ Q2.播種後24時間後のmRNAしか確認していないのですが、本来、もっと長時間培養して、発現量の上昇がちゃんと長く続くかどうか確認した方がいいのでしょうか？ 以上、教えていただけますと光栄です。 よろしくお願い致します。

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