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(無題) 削除/引用 No.1905-18 - 2010/01/16 (土) 18:42:10 - 774 そうだったんですね。すみません、考え違いしてました。 お役に立てないどころか、時間を無駄にしてしまい申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.1905-17 - 2010/01/15 (金) 13:40:45 - くれの >>774さん > もう方針を決めておられて必要ないのに、しつこくすみません。 いえいえ、非常に有難いです。 > 目的のインサートの最初のコドンをABCとするとEcoRI平滑化ーHindIII平滑化のライゲーション後の読み枠は、 > cGA ATT AGC TTx ABC　となるのでstopコドンは出現しないのでは・・・ > "x"は無いです。 ですので774さんのアドバイスに従うと G AAT TAG CTT ABC になってしまうのです。 もしかして何か私が勘違いor見過ごしてて、実はもっと単純にことが運んだりしますかね？ どうにもこの手のパズルが（も）苦手でして、、、 御教授頂けると有難いです。

(無題) 削除/引用 No.1905-16 - 2010/01/15 (金) 10:52:43 - 774 もう方針を決めておられて必要ないのに、しつこくすみません。 目的のインサートの最初のコドンをABCとするとEcoRI平滑化ーHindIII平滑化のライゲーション後の読み枠は、 cGA ATT AGC TTx ABC　となるのでstopコドンは出現しないのでは・・・

(無題) 削除/引用 No.1905-15 - 2010/01/15 (金) 04:12:29 - くれの >>774さん 有難うございます。 > ベクターをEcoRI処理後に平滑末端にして、SalIで切断。 > インサートをHindIII処理後に平滑末端にして、XhoIで切断。 > 片側平滑末端、XhoI-SalIライゲーションではどうでしょう？ フレームは見事に合いました、が、stopコドンの野郎が、、、 HindIIIの認識配列AAGCTTの内、AGの部分がどうにもダメみたいです。 皆様有難うございました。 おかげさまで方向が見えて来ました。 今の所、インサートをHindIII-XhoIでカットし、ベクターのHindIII-SalIサイトに入れ、その後、SacIカットしてPfu（or Klenow or T4 DNA polymeraseを買って）を使って削ってみようと考えております。

(無題) 削除/引用 No.1905-14 - 2010/01/14 (木) 15:54:54 - 774 フレームの計算が自信ないところですが・・・ ベクターをEcoRI処理後に平滑末端にして、SalIで切断。 インサートをHindIII処理後に平滑末端にして、XhoIで切断。 片側平滑末端、XhoI-SalIライゲーションではどうでしょう？ SalIより前にあって、平滑末端することでフレームが合う制限酵素を使えばいけそうな気がします。 インサート内にサイトがあってもライゲーション前なので関係ないですし。 勘違いしてたらすみません。

(無題) 削除/引用 No.1905-13 - 2010/01/14 (木) 13:47:40 - くれの APさん、有難うございます。 >[Re:11] APさんは書きました : > 蛇足ですが、cut->blunting->再環状化してトランスフォーメーションする場合、切れ残りがあるとあたりが取れにくいので、再環状化の前に切り出しをするほうがいい思います。 そうしてみます。 T7のくだり失礼致しました。カタログのRNAの二本鎖を分解しない、という説明を都合良くDNAの、と誤読していました。S1 nucleaseとかmung bean nucleaseも候補として検討してみます。 さらに質問で申し訳ないのですが、Klenowで埋めた場合、T4で削った場合、5'の状態（懸念しているのは5'リン酸化、非リン酸化の状態）は保持されていると考えて問題ないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1905-12 - 2010/01/14 (木) 13:35:26 - AP ちなみに、T4 polではなくPCR酵素を利用した平滑化システムもありますhttp://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2125

(無題) 削除/引用 No.1905-11 - 2010/01/14 (木) 13:29:09 - AP 蛇足ですが、cut->blunting->再環状化してトランスフォーメーションする場合、切れ残りがあるとあたりが取れにくいので、再環状化の前に切り出しをするほうがいい思います。

皆様有難うございます２ 削除/引用 No.1905-10 - 2010/01/14 (木) 13:19:53 - くれの >>Pumpkinさん > PCR的にやる方法は無理ですか？ 制限酵素サイトを付けたプライマーで伸長して、って方法でしょうか？だとしたらできれば避けたいなと。理由は前回、別のコンストラクト作り（PCRを使って）でどハマリしたのと、幾つかのmutantを一度に移したいのと、うちの部屋色々発注するのに手間が掛かる、と言ったくだらない理由です。勿論どうにもならない場合の選択肢では有ります。 >>ザンギさん > クレノーは好気条件で失活しやすいので、酵素液中の還元剤が死んでるかも え。。。 でも一先ず使ってみます。他に手が無い場合は。 念のためにfreshなDTTでも加えた方が無難ですかね？それとも既に酵素も死んでるのか、、、

(無題) 削除/引用 No.1905-9 - 2010/01/14 (木) 13:19:22 - AP >例えばPfuとかを想定してよいものですか？またこの場合も3’exo活性でDNAが削られ、SacI処理の後、酵素反応＝4塩基削り込み、と考えてよいのでしょうか？それとも単純に伸長反応で4塩基付加？ 3'突出端の削りこみです。いかなる酵素でも5'陥没端を伸長することはできません。 >また5’exo反応を起こす酵素として、T7 exonucleaseなるものをカタログ上でみつけたのですが、これはこの手のblunt end作製の際に有用、一般的なものか御存知有りませんでしょうか？ 5'突出端を削ってbluntingするのはpolymerase系では無理だと思います。確認していませんが、おそらくT７の場合も、多くのpolと同様、二本鎖特異的5'exo活性（nick translation活性）だと思います。もしやるなら、S1 nucleaseとかmung bean nucleaseのような一本鎖特異的nucleaseを使うのが一般的でしょう。

皆さん有難うございます 削除/引用 No.1905-8 - 2010/01/14 (木) 13:08:18 - くれの >>おおさん > Hind IIIで切ってクレノー、ライゲーションするとNheIサイトができるので > NheIでもう一度きってさらにクレノーすると8ベースはいらないっけ、、、 お！っと思ったらstopでした。しかしXhoIでカット、クレノー、PvuIで再びカット、クレノーで行けるかも知れません。問題は制限酵素があるかなのですが。 >>みみさん > フレームを合わせたいのはN末側，C末側どちらでしょう？ > インサートの方をXhoI，ベクターの方をSalIで切ってコンパチで入れられませんか？ > EGFPならこのサイトはフレームがずれていますが。 説明不足、不正確ですみませんでした。 入れたいのはGFPのC末側で、正確にはHindIII-insert-XhoI（他に切れるサイトはXhoI下流のXbaIだけです）をGFP vector側のHindIII-SalIに入れる予定でいます。 ただ手持ちのGFPは一種類でどうしてもコドンがずれてしまいます。またBglII、BamHIは残念ながらインサート内部に、、、 >>APさん > また、PCR用酵素の多くは強い校正活性をもつものも多いですから、そいつを利用することもできるでしょう。 例えばPfuとかを想定してよいものですか？またこの場合も3’exo活性でDNAが削られ、SacI処理の後、酵素反応＝4塩基削り込み、と考えてよいのでしょうか？それとも単純に伸長反応で4塩基付加？ また5’exo反応を起こす酵素として、T7 exonucleaseなるものをカタログ上でみつけたのですが、これはこの手のblunt end作製の際に有用、一般的なものか御存知有りませんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1905-7 - 2010/01/14 (木) 12:45:51 - Pumpkin PCR的にやる方法は無理ですか？

(無題) 削除/引用 No.1905-6 - 2010/01/14 (木) 12:21:53 - ザンギ クレノーは好気条件で失活しやすいので、酵素液中の還元剤が死んでるかも しれないような古いのは使わない方が無難かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1905-5 - 2010/01/14 (木) 12:10:47 - みみ あとEGFPだったら上流にBglIIがあると思います。 インサートが何で切り出せるか分かりませんが，BamHIとのコンパチも使えるかも。 自分はクレノー処理とか面倒くさいので，なるべくそのようにコンストラクションしています。 あとで切り出せなくなる欠点はありますが....。 すでに考えられていたらすいません。

(無題) 削除/引用 No.1905-4 - 2010/01/14 (木) 11:54:35 - みみ フレームを合わせたいのはN末側，C末側どちらでしょう？ インサートの方をXhoI，ベクターの方をSalIで切ってコンパチで入れられませんか？ EGFPならこのサイトはフレームがずれていますが。

(無題) 削除/引用 No.1905-3 - 2010/01/14 (木) 11:39:37 - AP KlnowもT4 polと同様、3’exo活性を持っています（確か2桁くらい弱いけれど）。なのでdNTP存在下でSac Iの突出端を削って平滑化することも可能です。Klnowは多めに入れた方が良いかもしれません（逆にfill-inして平滑化するときは削り込みが起きないように入れすぎるなというくらいで）。 また、PCR用酵素の多くは強い校正活性をもつものも多いですから、そいつを利用することもできるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1905-2 - 2010/01/14 (木) 11:32:17 - おお Hind IIIで切ってクレノー、ライゲーションするとNheIサイトができるので NheIでもう一度きってさらにクレノーすると8ベースはいらないっけ、、、 2ステップならほかにもやりようがあるなあ、、、 ストップができるかはご自身で確認してね。 pBSとかのマルチクローニングサイトでフレームが合いそうな部分をほりこんでしまうとかもできるかもねでも短すぎて大変でしょうけど。 それかHindIII、XhoIできっといてなんにもせず大腸菌にぶち込んで 大腸菌が末端を適当に補ってくれるだろうから、それをどんどんシーケンス に回すとか、、、どのくらいの確率でうまくいくか知りませんけど、、、 それかTaqでTとかAいれるとうまく行くかも、、一種のパズルなので ご自身でお考えください。

ベクターを削るか埋めるか 削除/引用 No.1905-1 - 2010/01/14 (木) 10:57:14 - くれの お世話になっております。 貰い物のベクター内のインサートを他の発現ベクター（EGFP）に移そうとしております。 使える制限酵素が限られており、移すには移せるのですがコドンがズレてしまいます。そこで移した後に、リンカー部分の制限酵素でカットし埋めるか削るかしてコドンを合わせようと考えております。 使用できるDNA配列（制限酵素）の並びは以下の通りです。 CTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGAC （XhoI,SacI,HindIII） （EcoRI、PstI、SalIはinsert内も切ってしまいます） 4（or1）塩基削るか、8（or2or5）塩基足すかでコドンが合うはずなのでラボ内の冷凍庫を漁った所、Klenowを発見しました（ただT4 DNA polymeraseが無い）。 XhoIで切った後、クレノー処理、その後HindIIIで切って再びクレノーで行けるかと思ったのですが、どうやらstopコドンが出来てしまうようです。 何か良い方法はないものでしょうか？もちろん材料が足りなければ探すor購入する予定です。

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