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(無題) 削除/引用 No.1902-13 - 2010/01/15 (金) 02:51:59 - おお >[Re:9] ザンギさんは書きました : > >[Re:6] おおさんは書きました : > > >[Re:3] ザンギさんは書きました : > > > > キレイなプラスミドが取れた記憶がないので。 > > > > あれれそうでしたか、どんな感じだったのか教えていただきますでしょうか、、、、 > > > > 遥か彼方の記憶なので不確かと前置きをして．．． > > ゲノムが断片化したようなコンタミが多かったような気がします。 > おそらくその時は死菌が多かったんでしょうね。 たしかにしきんが多くなる可能性はありますね。 私もルーティンにはやりませんので、コロニーが拾えるか拾えないか のあたりで回収にはいってたと思います。 ありがとうございます

(無題) 削除/引用 No.1902-12 - 2010/01/15 (金) 02:49:35 - おお >[Re:10] ＤＤＤさんは書きました : > >シングルコロニー拾う→ミニプレップ→トランスフォーメーション→そのままラージ > この流れで問題ありだと言われるところが理解できません。 > > シングルコロニー→miniprep > シングルコロニー→maxiprep > って同じ操作だと思うんですが・・・。 これで一番危ないところは、オリジナルのプラスミドがコンタミしている時、 ニックなどが入ったDNAが顕著で大腸菌に入っても増える段階で大腸菌 の中で適当に継ぎ接ぎしたDNAが増える可能性がだいのとき。 結局はシングルからふやして、ラージいもっていって増殖中頻度は非常に低い にしてもプラスミドは変わりえるわけで、それならちゃんとしたプラスミドを トランスフォーメーションしてそのままラージに持っていっても大きな違いは ないとは感じます。どこの部分を重要ししなければならないかということだと おもいます。

ありがとうございました 削除/引用 No.1902-11 - 2010/01/15 (金) 00:15:11 - めめ 皆様、 たくさんのご意見をありがとうございました！ ラージカルチャーで取れたプラスミドの制限酵素パターンも、 シークエンスも一部確認しています。 ただ、コレは長い遺伝子（約10kb)なので、全配列は読んでいません。 シングルコロニーから、プレートに線画培養する、という方法は 知りませんでした。 覚えておきます。 ありがとうございます。 ベクターはいわゆるクローニングベクターです。 （多少改変があるようですが。） 発現ベクターではありません。 遺伝子はマウスの遺伝子です。 ごく普通の方法で行くはずでした・・・。 が、プラスミドそのものが抜けます。 皆様のように、「コレで良いのでは？」と言って頂けると 良いのですが・・・。ため息が出ます。 in situさまのおっしゃるように、 『極微量だとしても混じっている可能性があるメイン以外のプラスミドが、下流の実験で何らかの悪さをする』 ということかと思います。 が。。。 通常は普通にとれば、極微量でも変な物は混じらないと思います。 それに、この可能性はどういうときにでも存在すると思うので、 これを言われてしまうと、「どうしろと・・・？」と思います。 ミニプレップでとったものですが、シングルコロニーからとっています。 もう一度トランスフォームすることで、プラスミドの変異が 起きやすいのか、だからシングルでないということなのか、 を知りたいと思いました。 でも、皆様のお話から、どうも、大丈夫そうな印象です。 もちろん、DNAに問題は見つかっていませんし。 今度は、きちんと、どういうことを心配されているのか、 どうしたらいいと思われるのか、をお尋ねしたいと思います。 （ちょっとこわいですが。。。） 今回は本当にありがとうございました。 とても助かりました。 いつか、皆様にお返しできたら、と思います。 失礼致します。

横からすみません 削除/引用 No.1902-10 - 2010/01/14 (木) 21:15:36 - ＤＤＤ >シングルコロニー拾う→ミニプレップ→トランスフォーメーション→そのままラージ この流れで問題ありだと言われるところが理解できません。 シングルコロニー→miniprep シングルコロニー→maxiprep って同じ操作だと思うんですが・・・。

(無題) 削除/引用 No.1902-9 - 2010/01/14 (木) 12:18:22 - ザンギ >[Re:6] おおさんは書きました : > >[Re:3] ザンギさんは書きました : > > キレイなプラスミドが取れた記憶がないので。 > > あれれそうでしたか、どんな感じだったのか教えていただきますでしょうか、、、、 > 遥か彼方の記憶なので不確かと前置きをして．．． ゲノムが断片化したようなコンタミが多かったような気がします。 おそらくその時は死菌が多かったんでしょうね。 バクテリアが個体培地表面でコロニーを形成するときは、垂直方向に１層の ままで水平方向にだけ増えていくときの細胞数をカウントすると対数増殖に 近いけど、それ以降は対数増殖ではありません。

(無題) 削除/引用 No.1902-8 - 2010/01/14 (木) 11:24:59 - in situ 多分、シングルでないというクレームをつけた方は、 『極微量だとしても混じっている可能性があるメイン以外のプラスミドが、下流の実験で何らかの悪さをする』 ことを心配されているのだと思います。 プラスミドからウイルスを作製するような際に、このような変なプラスミドからできたものがメインになる可能性がありますし、変なプラスミドからできた産物がドミネガ的に働く可能性も考えられます。 一応シングルコロニーを拾うという方法は、他のプラスミドが混入していないことの確証を得る今のところ最も確かな方法なので、そこにこだわる人も多いと思います。（ただし、この方法ですら、ごく一部のプラスミドが変異したという可能性は排除できないわけですが） したがって、以上の論理から言うと、泳動でチェックして問題ないとか、シークエンスを読むとかは説得にならないと思います。 ただ、今回の場合、 シングルコロニー拾う→ミニプレップ→トランスフォーメーション→そのままラージ という操作で、シングルコロニー拾ってから変異を誘発するような操作はしていないので、シングルと言ってもよいと思いますが…

(無題) 削除/引用 No.1902-7 - 2010/01/14 (木) 11:06:18 - 質問 プラスミドが抜けるのでしょうか？それともインサートが抜けるのでしょうか？ それとセレクションは何で掛けていますでしょうか？ それとベクターは動物発現用？大腸菌発現用？それともクローニングベクター？

(無題) 削除/引用 No.1902-6 - 2010/01/14 (木) 10:58:42 - おお >[Re:3] ザンギさんは書きました : > 過去ログにたくさんある「プラスミドが落ちる」現象と思います。 > > それから、僕ならプレートから直接菌体回収してプラスミド抽出という方法は > とりません。 > キレイなプラスミドが取れた記憶がないので。 あれれそうでしたか、どんな感じだったのか教えていただきますでしょうか、、、、

(無題) 削除/引用 No.1902-5 - 2010/01/14 (木) 10:52:05 - いぷ 制限酵素パターンだけではなく、ラージで取れたプラスミドのシーケンスを確認してはいかがでしょうか？ 取れたプラスミドが確実に目的のものであることを実証できれば、どのような方法で取ったプラスミドでも問題無いと思うのですが。

(無題) 削除/引用 No.1902-4 - 2010/01/14 (木) 09:55:40 - 千夏 >それはシングルではないので、問題だ、というクレームが付きました。 むしろなんでシングルでないのかが知りたいぐらいなんですが・・・。

(無題) 削除/引用 No.1902-3 - 2010/01/14 (木) 09:12:08 - ザンギ 過去ログにたくさんある「プラスミドが落ちる」現象と思います。 それから、僕ならプレートから直接菌体回収してプラスミド抽出という方法は とりません。 キレイなプラスミドが取れた記憶がないので。 今回の一度限りの実験ならプレート法でいいかもしれませんが、液体培養の コツをつかむ方が再現良くできます。

(無題) 削除/引用 No.1902-2 - 2010/01/14 (木) 02:57:51 - おお 確かに変わりやすいプラスミドがありラージでトラブルになることがあります。 安定に保つために幾らかコツはあるようですが、絶対にきまったものが あるわけではなさそうです。 プレート上で培養する方が比較的培養条件がいいという話を聞きますので 得られたシングルコロニーを液体でミニプレップすると同時に、新しい プレートに線画培養し、そのプレートから大腸菌を回収するとか私 ならするかもしれません。 プレート１枚に500ぐらいコロニーがあればそこからちょく回収しても 結構な量だと思いますし、プレートに液体バイチを加え回収して ラージにうつすとか。 あとは対数増殖期の後期で直ぐに回収するほうがいい場合が結構あります。 ただしシングルのクローンではないと指摘があったとしても あなたのやり方でそんなに大きな問題は感じないと思います ただ、ミニプレップでとったDNAをマスターで持っておいた方が いいと思います。

トランスフォームするとプラスミドが変わる？ 削除/引用 No.1902-1 - 2010/01/13 (水) 23:47:50 - めめ 変わったプラスミドを扱っていて困ってる大学院生です。 教えてください。 今、扱っているプラスミドはコロニーからミニプレップでチェックすることはできます。 が、そのミニプレップの残りをラージカルチャーにすると、プラスミドが 抜けてしまいます。 ラージにしなくても、もう一度〜5mlほどのミニカルチャーにしても同じです。 どうも、大腸菌が長時間培養を気に入らないプラスミドのようです。 そこで、ラージカルチャーに持って行くために、 「シングルコロニーを拾うーミニプレップ」 でとったプラスミドサンプルを、トランスフォームし直して、 そのままラージカルチャーに移してプラスミドをとりました。 この方法でプラスミドは取れています。 プラスミドの制限酵素パターンは正常です。 ですが、トランスフォームをしてそのまま増やすと、 それはシングルではないので、問題だ、というクレームが付きました。 確かに、シングルコロニーから増やしてはいません。 2段階だとプラスミドが抜けてしまうからです。。 トランスフォームをするとDNAが変わってしまう危険があるということでしょうか。 シングルコロニーからとったプラスミドですが、均一ではないので、 トランスフォームすると混ざった物になる、と考えるべきなのでしょうか・・・。 それとも気持ちが悪い。。。ということでしょうか。。。 このプラスミドをトランスフォームして、コロニーから精製しないで、 ラージカルチャーに行くことは、どこがまずいのでしょうか。 よろしくお願いします。

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