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(無題) 削除/引用 No.1894-8 - 2010/01/14 (木) 02:42:53 - おお 4量たいらしいということですよね、、、 全くモノマーは見られませんか? もしかしたら4量たいの一つにDNAが結合して その結合したDNAが他の4量たい分子と結合したりして 架橋したような状態でおおきなコンプレックスに なっているんでしょうか、、、 DNAを小さくするか、結合条件を厳しくするか モノマーに解離するような条件を探すか、、、、 くわえるDNAを減らすとかしてもいいかもしれませんね。 精製したタンパクなのでモルひも計算できますし、 タンパク量と同じモル数入れても検出できる くらいになるのではないでしょうか? 架橋を気にするならさらにDNAを減らしたほうがいいかもです。 あとは前に書いた デタージェントの量、種類を幾らかためしてみるとか プローブを短くしてみるとかマグネシウムを減らすとか、 EDTAを入れてみるとか、塩濃度を上げてみるとか。 NP-40はよく使われますけどね。1%ぐらいまであげても 場合によってはいいかもしれません。 ゲルにも0.1%ぐらい加える手はありますよ。 その他使えそうなのはデオキシコール酸 CHAPSとかでしょうか。やってみないと分からない というのが本とのところですが。

(無題) 削除/引用 No.1894-7 - 2010/01/13 (水) 22:56:00 - おだ アドバイスありがとうございます。 >好熱性ということなので思い切ってプレランで 温度を50度そこらに上げて電気へいどうというてはないかなぁ。 次も同じように駄目だった場合、チャレンジしてみようと思います。 >反応溶液中にデタージェントを入れることは考えてはないでしょうか? 現在界面活性剤として、NP-40というものを加えているのですが、それとはまた違った効果が得られるものなのでしょうか？ >プローブのサイズはいくらぐらいでしたっけ、、、、 だいたい300bp近くのプローブを使っています。 >タンパクはゲル濾過で適切なサイズにきますか? 分子量測定を行ったところ3.5量体という結果になってしまい、ダイマー単位であることを予測して、おそらく4量体であろうという形で止まってしまってます。ちなみにSDS-PAGEでは適切な位置に来ます。 今回、もう一度加えるタンパク量をふってみたところ、目的のタンパクを少量加えた条件ではなんとかバンドが確認されました。やはりタンパクの加えすぎだったようです。しかしそこにさらに別の転写因子を加えるとやはりバンドが消えてしまいました……

(無題) 削除/引用 No.1894-6 - 2010/01/13 (水) 14:21:08 - おお 好熱性ということなので思い切ってプレランで 温度を50度そこらに上げて電気へいどうというてはないかなぁ。 精製したタンパクであれば10-100ngのレンジでいいと思います。 反応溶液中にデタージェントを入れることは考えてはないでしょうか? プローブのサイズはいくらぐらいでしたっけ、、、、 他にも結合を見る方法があると思いますので、 そういう調査もされてみてはどうでしょうか? タンパクはゲル濾過で適切なサイズにきますか?

(無題) 削除/引用 No.1894-5 - 2010/01/13 (水) 11:59:45 - おだ >精製されたタンパクを使っているのでしょうかそれとも クルードなライセートでしょうか? 十分に精製できているタンパクを使っています。 >タンパクを加えてない状態（DNAやreaction mixや反応条件は全く同じ組成でタンパクのみがない溶液）ではちゃんと泳動されるのでしょうか？ 泳動はプレランはしていますか？何度で泳動していますか？ ネガコンのタンパクを加えていない状態ではちゃんと泳動されています。 泳動は常温で、100Vで60minプレラン後、やはり100Vで90min行ってます。 > タンパク質が多すぎてアグっているような感じがします。タンパク質の量を減らせませんか。 とりあえず、さっそくタンパクの量を振りなおしてやってみます。

(無題) 削除/引用 No.1894-4 - 2010/01/13 (水) 11:16:18 - やま タンパクを加えてない状態（DNAやreaction mixや反応条件は全く同じ組成でタンパクのみがない溶液）ではちゃんと泳動されるのでしょうか？ 泳動はプレランはしていますか？何度で泳動していますか？

(無題) 削除/引用 No.1894-3 - 2010/01/13 (水) 09:45:35 - おお 精製されたタンパクを使っているのでしょうかそれとも クルードなライセートでしょうか? もしクルードな抽出液を使っているのであったら、 精製したもので条件を見つけることはできないでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.1894-2 - 2010/01/13 (水) 00:37:23 - とおりかがり 高温で反応させつつ、（高温？or常温？で）泳動したり、いろいろ別の要因がある可能性もありますが、タンパク質が多すぎてアグっているような感じがします。タンパク質の量を減らせませんか。

転写調節因子タンパク質のEMSA 削除/引用 No.1894-1 - 2010/01/12 (火) 23:44:28 - おだ 超好熱菌の転写調節因子タンパク質の解析を現在行っているのですが、 その際EMSAによる解析がなかなかうまくいきません。 使用しているのはGE(アマシャム？)のEMSAキットで、biotin標識したオリゴをプローブとして使っています。 binding reactionは10mM TrisにKやMg等の塩、DTT、NP-40等を加えて、70℃で30min行っています(超好熱菌のタンパク質なので70℃でやっています)。 その後loading bufferを加えてから、5%のポリアクリルアミドのゲルにアプライし、0.5X TBE bufferで泳動しているのですが、タンパク質を加えた条件ではうまく泳動してくれません。 ほとんどバンドが見られないので、ウェルの部分もトランスファーしてみるとウェルの位置にしっかりとバンドが見えており、そこから少しも泳動してくれた気配がありません…… まわりにEMSA経験者がおらず自分も初心者なので、どのように改善したらいいのか見当もつきません。どなたかなにかアドバイスいただけたらありがたいです。

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