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(無題) 削除/引用 No.189-10 - 2009/03/16 (月) 23:05:28 - CJ 過酸化水素処理は問題ないですが、きになる場合は高濃度のアジ化ナトリウム（２％）とかでペロキシダーゼを失活させます。その後にbiotin blocking kitを利用すればよいですね。さらにこの場合は２つともウサギ抗体ですから、１回目の抗ウサギ抗体を吸収させるために、２回目のウサギ抗体の前に正常ウサギ血清で１回目の２次抗体をブロックする必要があります。 色の組み合わせですが、 １回目：DAB（茶）　２回目：Ni-DAB（青黒） １回目：Ni-DAB ２回目：TAPM（ピンク） １回目：Ni-DAB ２回目：VECTOR NovaRed(赤茶） を良く行っています。 TAPM法については以下の論文を参考にしてください。 Kaneko T., Caria M. A. and Asanuma H., Information processing within the motor cortex. II. Intracortical connections between neurons receiving somatosensory cortical input and motor output neurons of the cortex. J. Comp. Neurol. 345: 172-184, 1994.

パラフィン埋包切片 削除/引用 No.189-9 - 2009/03/16 (月) 15:13:22 - に パラフィン埋包切片の多重染色はここが参考になると思います。 http://www.nichirei.co.jp/bio/technical/tech_support/max-po_02.html BCIP/NBT発色（青色）、ニューフクシン発色（赤色）、DAB発色（茶色）の三重染色の方法が紹介されています。

以前のトピックにあったようです 削除/引用 No.189-8 - 2009/03/15 (日) 18:54:06 - Eire やまもと さん 蛍光標識2次抗体を使った方法については、このフォーラムの以前のトピックにあったのであげておきますね。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;Code=4144

(無題) 削除/引用 No.189-7 - 2009/03/15 (日) 16:49:13 - yama やまもとさん、ごめんなさい、書いてなくて。Alexa標識の2次抗体のことです。これはホルマリン固定されても蛍光に変化がありません。文献は出したいのですが、バレバレになるので・・　基本的に、手持ちの抗体（特にブロッキング用の抗体）の性質で条件は違うので、振るしかないです（大体、染色に使う濃度の10倍が目安）。でも、ネガコンをちゃんと置けば、使える条件が見つかりますよ。

(無題) 削除/引用 No.189-6 - 2009/03/15 (日) 09:59:58 - ats 経験がないので逆に質問ですが、過酸化水素の前処理で一回目のDAB染色は消えたり（薄くなったり）しないのでしょうか？問題ないなら、出来そうですね。チャレンジお待ちしています。 （yamaさんの方法は、なるほどと思いました。）

(無題) 削除/引用 No.189-5 - 2009/03/15 (日) 01:08:52 - やまもと atsさん、コメントありがとうございます。 一回目のフリービオチンは二回目のブロッキングで結合を防ぐことができるし、一回目のABCは基本的にはパーオキシダーゼなので、過酸化水素の全処理で失活できると思うのですが、どう思われますか？ kodaさん、コメントありがとうございます。 このキットを使われたことはありますか？これは、一次抗体を標識するもののようですが、そうすると、シグナルの増幅を必要とする抗体には不向きかなと思っていました。 yamaさん、コメントありがとうございます。 蛍光標識試薬というと、具体的には何を指すのでしょうか？蛍光標識された二次抗体なのか、それともTSAキットのような、増幅キットでしょうか？それと、一次固定後のホルマリン固定は有効とのことですが、よろしければ、詳細、またら参考文献がありましたら、教えて頂けましたら幸いです。 よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.189-4 - 2009/03/14 (土) 18:27:07 - yama 蛍光標識試薬でならできます。論文に出したこともありますが、手持ちの試薬で条件設定をちゃんとやらないといけません。ABCはやったことないのでわかりません。蛍光の場合、要するに、最初に結合したすべての一次抗体が、2回目に反応させる抗体に対してinvisibleになるようにすればいいわけなので、超過剰の未標識抗体によるブロッキングを行い、それらが外れないように、その後のホルマリンによる固定を行えばいいです。

(無題) 削除/引用 No.189-3 - 2009/03/14 (土) 13:13:04 - koda 一般的には無理では？ 私は使ったことはありませんが、蛍光標識で良ければインビトロジェンからZenon標識キットが出ていたと思います。

(無題) 削除/引用 No.189-2 - 2009/03/14 (土) 08:01:06 - ats 経験がないので想像ですが、一回目のABCのフリービオチンに２回目のABCが結合すると思われるので、２重染色は無理でしょう。また、一回目のABCの酵素はどのように失活させるつもりですか？

２つのウサギポリクローナル抗体を用いた二重染色 削除/引用 No.189-1 - 2009/03/14 (土) 05:32:21 - やまもと 題目通りなのですが、一次抗体がどちらもウサギポリクローナルの場合、ABCキットで反応後、DABの二色使いで二重染色することが可能かと思われますが、そのような染色をした経験のある方、コメントをお願い致します。 また、きれいに染色しなかったという経験のある方には、その時の打開策を教授していただけましたら幸いです。 よろしくお願い致します。

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