細胞を集めるのにトリプシンを使う事について、確かにそういう方法もありとは思うのですが、これから蛋白質を調べる実験をする前にプロテアーゼを使うのもどんなもんかなあ？、とちょっと思っていて、それで私は直接Lysis buffer 入れて溶かしてセルスクレーパーとピペットで回収してます。SDS buffer ならほとんど溶けてしまい、沈殿はほとんどないかもしれないですが、マイルドなbufferならば遠心して不溶画分と上澄画分に分けて、それぞれをSDS sample bufferに溶かして解析してます。（ここでも時々話が出ていますが、両方チェックすることが大切）
コートしている蛋白質が入ってくるのは確かに避けられないと思うけど、幸いコラーゲンもラミニンもけっこう高分子量蛋白質だし（100KDa以上？）、それにウェスタンならばコンタミあってもあまり気にしなくてもいいのでは。ただあんまり混じると電気泳動のとき相対的に細胞の蛋白質が少なくなって、微量蛋白質とかだとまずかもしれないけど。
一つの方法として、少量のPBSをディッシュに入れてセルスクレイパーで細胞をやさしくかき集めてそのけんだく液をチューブに移し500xg, 1~3分くらい遠心して細胞を集めて上澄みは捨てて、沈殿したその細胞にlysis bufferを入れて、という感じにすれば上記のような問題はかなり減らせるのでないでしょうか。ちょうどトリプシン無くて、スクレイパーで集めた細胞を継代した事あるけど普通に生きてて増えたので、乱暴な事しなければ大丈夫と思う。
コラーゲンはたしかトリプシンでは分解されにくいとおもいます。コラーゲン壊すのはコラゲナーゼです。変性したり酸化されたコラーゲンはトリプシンでも分解されやすくなるけど。 |
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