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(無題) 削除/引用 No.1865-7 - 2010/01/12 (火) 09:25:21 - 初心者です モモ様、おお様　お返事ありがとうございます。 >[Re:5] モモさんは書きました : > > ウエスタンは何か特殊なことをしているのでしょうか？ dimerはコバレントに結合していますので、還元剤の入っていないsample bufferで溶出し、SDS−PAGEを行っています。

(無題) 削除/引用 No.1865-6 - 2010/01/09 (土) 04:15:28 - おお >[Re:4] 初心者ですさんは書きました : > >[Re:2] おおさんは書きました : > > > > 質問から内容が把握できません。 > > マルチマーはへテロのタンパクを考えているのですか? > > 37kDa以外にバンドが期待できるのですか? > > できるとしたらウエスタンで検出できましたか? > > マルチマーはホモで、dimerは74ｋDa付近にバンドが出ます。paperではトランスフェクションしたcell lysateをウェスタンした際に、上記の位置にバンドが出ることが確認されています。私もELISAのスタンダードをIP→ウェスタンしたところ、その付近にバンドがでています。 Are you saying no signal appeared in the lanes from the serum at any size? > IPは > ・bufferのみ > ・ELISA standard > ・患者血清 > でビーズとincuvateした結果、ELISA standardのみに37及び74kDa付近にバンドがでていましたので、目的たんぱくを捕まえていると思っていましたが違うでしょうか。血清中のalbuminやIgGがIPの邪魔をしているのかと思い、血清にELISA standardを加えてIPしたのですが、バンドを見る限りその影響はないように思われました。 I thought you got non-specific signals with ELISA......

(無題) 削除/引用 No.1865-5 - 2010/01/09 (土) 02:40:31 - モモ >マルチマーはホモで、dimerは74ｋDa付近にバンドが出ます ウエスタンは何か特殊なことをしているのでしょうか？ ネイティブペイジとか、クロスリンキングとかでしょうか？ 私の理解では、普通のウエスタンであればサンプルを作った時点で 蛋白同士の会合は壊れてすべてモノマーになると思うのですが。 それとも、コバレントに結合しているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1865-4 - 2010/01/08 (金) 11:47:31 - 初心者です おお様,モモ様　お返事ありがとうございます。 >[Re:3] モモさんは書きました : > 状況から考えられる一番シンプルな結論はELISAが目的の蛋白（３７ｋD）を見ていないのではないかと思いました。 私も最初はそう思いました。ELISAは市販のkitを使用しており、いろいろなpaperで多用されています。 ELISAではdupliecateでCV値が6％以下で、操作自体に問題はないのではないかと言われました。 ELISAでcaptureとして使用している抗体はmanualが何度か改訂され、昔のmanualには抗体名が書かれていましたが、最近のmanualでは記載されなくなったので変更されたのかもしれません。何種類か抗体が市販されていますので、経済的に可能な限り試そうかと思います。 >[Re:2] おおさんは書きました : > > 質問から内容が把握できません。 > マルチマーはへテロのタンパクを考えているのですか? > 37kDa以外にバンドが期待できるのですか? > できるとしたらウエスタンで検出できましたか? マルチマーはホモで、dimerは74ｋDa付近にバンドが出ます。paperではトランスフェクションしたcell lysateをウェスタンした際に、上記の位置にバンドが出ることが確認されています。私もELISAのスタンダードをIP→ウェスタンしたところ、その付近にバンドがでています。 > 血清のIgGなどのノンスペとか拾っているようで、、、 > どのようにネガコンを取っているのでしょうか、、、 IPは ・bufferのみ ・ELISA standard ・患者血清 でビーズとincuvateした結果、ELISA standardのみに37及び74kDa付近にバンドがでていましたので、目的たんぱくを捕まえていると思っていましたが違うでしょうか。血清中のalbuminやIgGがIPの邪魔をしているのかと思い、血清にELISA standardを加えてIPしたのですが、バンドを見る限りその影響はないように思われました。

(無題) 削除/引用 No.1865-3 - 2010/01/08 (金) 05:18:16 - モモ 状況から考えられる一番シンプルな結論は ELISAが目的の蛋白（３７ｋD）を見ていない のではないかと思いました。 ELISAは市販のキットでしょうか？それとも自作のものでしょうか？ 市販のものであれば、使っている抗体はそれなりに特異性があるものでしょうから、あとは十分なWASHをしているかどうかぐらいしかチェックするところはないですが。

(無題) 削除/引用 No.1865-2 - 2010/01/07 (木) 13:50:33 - おお 質問から内容が把握できません。 マルチマーはへテロのタンパクを考えているのですか? 37kDa以外にバンドが期待できるのですか? できるとしたらウエスタンで検出できましたか? 血清のIgGなどのノンスペとか拾っているようで、、、 どのようにネガコンを取っているのでしょうか、、、

血清の免疫沈降 削除/引用 No.1865-1 - 2010/01/07 (木) 10:17:25 - 初心者です 実験初心者です。 現在血清に対して免疫沈降→ウェスタンを行っています。 血清中の目的タンパクをELISAで測定したところ、highとlow titerの群に分かれました。目的タンパクはmultimerを形成しますが、ELISAでは識別できないため、IP→ウェスタンにて構成比を調べようとしています。 IPにはELISAでcaptureとして使用した抗体を使用していますが（IP適用です）ELISAでhighとlowに分かれた血清が、ウェスタンではどちらも目的の位置（37ｋDa付近）にバンドがでてきません。ELISAのstandardをhighの方と同等の濃度になるように血清に添加し、IPを行った場合はバンドが確認できます。 このような場合どういった解決法があるのか、教えていただけたらと思います。 宜しくお願いします。

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