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(無題) 削除/引用 No.1858-9 - 2010/01/11 (月) 23:29:03 - 分泌 N型糖鎖が結合するかどうかは配列で簡単に予測でき、望ましくない場合は、アミノ酸置換すれば回避することもできますが、一番難しいのは、システインを含む場合です。核蛋白の多くは含むと思いますが、これを分泌系に入れるとたいていは近傍のシステインとS-S結合を作ってしまいます。培地にＤＴＴを入れておく手もありますが、分泌されにくくなる場合もあります。 そういう問題がない場合は、たしかに、たとえばSigmaからの3xFLAGのsignal sequenceがついた分泌型のベクターp3XFLAG-CMV™-8などに入れたものを、invitrogenから出てるようなfree styleなどで大量に分泌させれば、培地を回収するだけで良いので、精製も簡単で量も結構とれることはあります。

(無題) 削除/引用 No.1858-8 - 2010/01/11 (月) 13:37:08 - 石橋叩 発現量を改善させる目的で、本来は核に局在するタンパク質を細胞外に分泌させるということは普通はやらないと思います。理由はatsさんがお書きになっている通りです。ただし、atsさんが仰るように、やってみたら改善したということがあり得ないとも言えません（やってみないとわからない）。 そもそも、どうしてそうすれば発現量が改善するとお考えになったのですか？

(無題) 削除/引用 No.1858-7 - 2010/01/11 (月) 00:54:35 - Incognito 以前、酵母のCarboxy peptidaseを過剰発現、 且つα facotr leader配列を用いて分泌発現させていましたが、 大部分のCarboxy peptidaseには糖鎖が付加されていませんでした。 (SDS-PAGEで確認しています) 糖鎖修飾等の修飾がかかるたんぱく質を過剰発現させるのならば、 分泌発現は避けたほうがよいかと思われます。

(無題) 削除/引用 No.1858-6 - 2010/01/10 (日) 11:40:21 - ats > もともと分泌しないタンパク質を分泌シグナルを付加して、過剰発現する成功例がありますか？今調べてるところなんですが、なかなか見つからなくて、昔の論文を検索した方がいいかな？ ”過剰"発現ではないですが、現在そのような実験をしています。だたしドメインの一つのみですけど。 多量のタンパクを調製する目的だと難しいと思います。酵母発現系の方が良いのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1858-5 - 2010/01/10 (日) 01:40:59 - 通りがかり こんなのとか。 "High level expression and secretion of Fc-X fusion proteins in mammalian cells" Protein Engineering, Vol 11, 495-500, 1998 分泌シグナルだけだと苦しいんですかね。

(無題) 削除/引用 No.1858-4 - 2010/01/09 (土) 17:28:01 - Mavia ご返答ありがとうございます。 核タンパク質を分泌シグナル付けて、培地に分泌させようと思いましたけど、収量が多くなるのを期待してたけど、やはり翻訳後修飾などのことを考えて、難しいですね？ もともと分泌しないタンパク質を分泌シグナルを付加して、過剰発現する成功例がありますか？今調べてるところなんですが、なかなか見つからなくて、昔の論文を検索した方がいいかな？

(無題) 削除/引用 No.1858-3 - 2010/01/06 (水) 09:42:13 - ats ちょっとだけ経験がある素人の意見として、 質問(1)に対して、やってみないとわからないと思います。 分泌経路で予期せぬ修飾（糖鎖付加など）が生じる可能性があること、foldingメカニズムが異なるため正常な高次構造を形成するか否か不明であることなど、欠点もあることを考慮してください。得られた産物を評価するために生理活性のアッセイ系が必要でしょう。糖鎖付加部位に関しては予測ができるようです。 質問(2)に対して、注意することは、シグナルペプチドの切断部位直後のアミノ酸配列(3アミノ酸くらい？？）も切断効率・切断部位の決定に重要ですので、単にシグナルペプチドと目的の配列を連結するだけでは失敗する可能性が高いことです。もともと分泌タンパクなら成功する可能性は高いと思います。 なお、市販のベクターではIL2やPreprotrypsinのシグナルペプチドが使われているものがあります。私も別件で論文を探している途中ですが、Gaussia Luciferase由来の配列の分泌効率が良さそうな感じです。付帯情報も入手できるので配列はご自分でお探しください。

(無題) 削除/引用 No.1858-2 - 2010/01/06 (水) 08:13:19 - おお > 質問�@：細胞内の過剰発現に比べ、発現したタンパクを細胞外に分泌させたほうが高発現量が得られるのですか？ これについてはそういうのに興味がなかったのでよく分かりません。 細胞内にあるものを分泌して得ようというのはちょっと私の考える 実験の範囲内ではあまり好ましくないという懸念がありますから。 > 質問�A：哺乳類細胞外分泌シグナルペプチドの配列を教えてください（文献があったら、是非）。 これは分泌用のベクターとかインビトロジェンとかで売ってたと思いますし 検索でも比較的すぐひっかかってくるのでは? 細胞の分子生物学とか典型的なものが載っているような気がしますし、 そこからリファレンス引いてもいいかもしれません。

哺乳類細胞外分泌シグナルペプチドの配列 削除/引用 No.1858-1 - 2010/01/05 (火) 21:16:02 - Mavia HEK293細胞を用いて、あるタンパク質を過剰発現しようとしているところです。 質問�@：細胞内の過剰発現に比べ、発現したタンパクを細胞外に分泌させたほうが高発現量が得られるのですか？ 質問�A：哺乳類細胞外分泌シグナルペプチドの配列を教えてください（文献があったら、是非）。

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