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(無題) 削除/引用 No.1856-16 - 2010/01/06 (水) 12:38:57 - う 私がこれまでにチェックしたのものには無かったが・・・。 だから、主観かもしれないと書いてあるのだが。 そもそも、「成書に書かれていること」が、 ほとんどの遺伝子に起こること一般的なこと、か それとも、一部の遺伝子で起こる特殊なこと、か そういうこと基準になることではないでしょ。 もっとin situという手技的なことで確認することがあるでしょと言いたかっただけなのですがね。 はぁ。 ＞Northernによるprobeのcheckは基本の一つと言えまいか。 これはアンチセンスプローブが使えるかどうかのチェックをするというのなら 基本の１つと言えると思われるが、 センス側のRNAも発現していることをチェックするためのセンスプローブのチェックのための Northernなら、基本とは言えないと思うが？ もっとin situという手技的なことで確認することがあるでしょと言いたかっただけなのですがね。 はぁ。

(無題) 削除/引用 No.1856-15 - 2010/01/06 (水) 12:23:00 - AP >特殊な（主観かもしれないが）事例を考えるのもいいが、 成書に書かれているくらいで、決して特殊なことではありませんよ。 sense probe, antisense probeを作ったらそれぞれをprobeにNorthernをやってみてご覧なさい。 >基本をやってから、珍しい現象ではないかと考えるならまだしも。 Northernによるprobeのcheckは基本の一つと言えまいか。

(無題) 削除/引用 No.1856-13 - 2010/01/06 (水) 10:22:50 - う あと、あまりに基本的なことなので書かないでいたが、もしや。 検出には何を使っているのでしょうか？ 検出はAPを使っているとしたら、もちろんネガコンとして プロープ無しと抗体無し、これらに染色液を入れて染める というのをしたのですよね？ 内在性のAPはかなり強く残ることがあり、特に経験的に上皮などは顕著であることがあります。 単に内在性のAPで染まっているとかあります、かなりクリアに。 それを見逃して、難し実験するとしたら、かなりのお笑いになってしまいます。

(無題) 削除/引用 No.1856-12 - 2010/01/06 (水) 10:16:37 - おお うさんの質問に付随してですが、どの程度の解像度でやってますか? 核と分かるところがそまっていると言えるかどうか、そのへんは 最初に状況説明がないので突っ込めませんでしたから、、、、 確かに非特異というのはなにをもって特異的でと疑いたくは なりますが、それもとくにコメントのしようがないですけど、 同じ、または同等のマテリアルで違う遺伝子で染めたことが ありますか?

(無題) 削除/引用 No.1856-11 - 2010/01/06 (水) 10:05:00 - う センス側も転写されているとか、乗り換えとか、 特殊な（主観かもしれないが）事例を考えるのもいいが、 その前に疑うことがあると思われるが。 ＞組織を観察すると血管壁や上皮にかなりピンポイントで染まり、バックグラウンドのように不鮮明な染まり方ではないので、おそらくシグナルではないかと考えていました。 そもそも、なぜセンスプローブを使って実験するのか？わかっていますか？ 何を非特異としてアンチセンスで検出するかもしれないと考えてセンスプローブを使うのか？ DNA（核など）を単にアンチセンスプローブで検出しているだけかもしれない、 という可能性を恐れるからでしょう？ 質問者様が言っているシグナルがどうなのか？考察されているのか？文章からは疑問。 転写されているということはDNAもほどけている状態が多く、 よりDNAを検出しやすくなっていると屁理屈も成り立つのではなかろうか。 あと、バックグラウンドや非特異なシグナルが「不鮮明である」保証はない。 クリアなシグナルでも、バックグラウンドはバックグラウンド。 非特異は非特異。 実験操作のwashの時間や温度、ハイブリの時間や温度、 もしやっているのなら、proK処理の時間など どの程度検討したのか、疑問。 基本をやってから、珍しい現象ではないかと考えるならまだしも。

(無題) 削除/引用 No.1856-10 - 2010/01/06 (水) 09:45:14 - C.C ＞APさん、おおさん わかりました！ Northernで確認して、asymmetric PCRでプローブを合成してみます。 詳しいアドバイスを下さり、ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.1856-9 - 2010/01/06 (水) 09:22:08 - ザンギ >[Re:8] おおさんは書きました : > アンチセンス側からの転写産物が出てないかはできる範囲で > 確認をしておいた方がいいと思います。 > トランスクリプトームの話なんかを聞いてると、アンチセンス鎖が転写されて いても不思議はないですよね。 昔、ｃＤＮＡライブラリーをベクターに組み込んでハイブリでスクリーニング してた頃に、アンチセンス鎖にポリA鎖がついてるのが結構取れてた気がする のですが、当時はアーティファクトと片付けてました。 今思えばそういうのだったのかなと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.1856-8 - 2010/01/06 (水) 08:16:48 - おお アンチセンス側からの転写産物が出てないかはできる範囲で 確認をしておいた方がいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1856-7 - 2010/01/05 (火) 19:22:46 - AP >鋳型の終了端が5'突出か平滑の断端になっていないと起こりやすいと言われている >⇒この場合どのような原理で不具合が発生するのでしょうか？ この現象については、Molecular Cloningなどの教科書やキットのマニュアル等でも注意が促されていると思います。 酵素が鋳型の末端に達しrun-offするときに、鋳型の反対鎖のフリーな3'突出端の一本鎖があると、そちら鋳型としてひょいと乗り換えてRNA鎖の伸長が続くんだと思います。また、環状のままの鋳型の場合、だらだら伸長を続けるうちに、by-chanceで反対鎖に乗り換えてしまうのだと思います。 >転写産物の伸長端で鋳型の乗換えが起こって、反対鎖が出来る。 >⇒このような場合の対策はどうすればよいのでしょうか？ 先にも書きましたが、最近はasymmetric PCRでstrand-specificプローブを作るのを第一選択としてます。 in vitro transcriptionでやるなら、転写効率を上げるのが一番の解決策かと思います。インプットに対して十分大量のプローブが出来れば、ほとんどの問題は解決する、というか問題にならないと思っています。長いほど難しくなりますから、出来るだけ短い鋳型にするとか、鋳型の精製度などにも気を配ってとか、 いずれにせよISH用に作ったprobeは、事前にちゃんとworkするか、あるいは反対鎖のプローブがシグナルを拾わないかを確認するため、Northernで使ってみるといいですね。

(無題) 削除/引用 No.1856-5 - 2010/01/05 (火) 17:55:41 - C.C ＞E.coliさん、CJさん 確かにコントロールもなしに特異的に見えるというのは乱暴ですよね。 組織を観察すると血管壁や上皮にかなりピンポイントで染まり、バックグラウンドのように不鮮明な染まり方ではないので、おそらくシグナルではないかと考えていました。 ＞APさん 転写産物の伸長端で鋳型の乗換えが起こって、反対鎖が出来る。 ⇒このような場合の対策はどうすればよいのでしょうか？ 鋳型の終了端が5'突出か平滑の断端になっていないと起こりやすいと言われている ⇒この場合どのような原理で不具合が発生するのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1856-4 - 2010/01/05 (火) 17:37:30 - AP 経験上、ファージプロモータ(T7/T3/SP6)からのin vitro transcriptionで作ったプローブは、センス鎖、アンチセンス鎖もプローブとして有効になってしまうことがかなり多くて、Northernをすると（強度に差があったとしても）同じ転写産物が検出されたりまします。 理由はいくつか考えられて、 ・転写産物の伸長端で鋳型の乗換えが起こって、反対鎖が出来る。鋳型の終了端が5'突出か平滑の断端になっていないと起こりやすいと言われている（3'突出の制限酵素で線形化しているとか、環状プラスミドが残っているとか）。 ・RNAプローブの量に対して、比較的多くの鋳型DNAが残存しているため、標的RNAー鋳型DNAーRNAプローブのハイブリッドが出来ている。DNase処理が不十分で鋳型が残存するというのももちろん考えられるが、インプットの鋳型DNA量に対して、RNAプローブの合成収量が低いときに問題になりやすいようだ（たしか、理想的にはインプットの10〜20倍のアウトプットが出来るはず）。 私たちの経験では、非対称PCRで一本鎖DNAプローブを作った方が、strand-specificityの高いものができます。

(無題) 削除/引用 No.1856-3 - 2010/01/05 (火) 17:15:50 - CJ 質問者様の技術に問題がないと仮定するなら、これは特定の遺伝子で起こる話かもしれません。 センスプローブは必ずしもネガティブコントロールにならないことが知られています。ある遺伝子ではせんす、アンチセンスの両者が脳内に発現するそうですよ。 ただ、私の見聞きした範囲では両者が同じパターンでは染まらなかったような…。 私も非特異的でない、と言い切る根拠が知りたいですね。

(無題) 削除/引用 No.1856-2 - 2010/01/05 (火) 17:06:16 - E.coli > 今までの経験から両プローブとも非特異なバックグランドではないように見えます。 その根拠はどういったものでしょうか？

in situ hybridizationでセンスプローブが同じ様に染まる 削除/引用 No.1856-1 - 2010/01/05 (火) 16:54:12 - C.C RNAプローブを用いてin situ hybridizationを行いました。 するとアンチセンスもセンスプローブも同じパターンで染まりました。 今までの経験から両プローブとも非特異なバックグランドではないように見えます。 このような場合どの様な原因が考えられ、どんな解決策を行えばよいでしょうか？同じ経験をされた方などがいらっしゃいましたらアドバイスをお願いします。

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