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(無題) 削除/引用 No.1853-14 - 2010/01/15 (金) 13:25:06 - すけ みなさま、いろいろと教えていただきありがとうございました。 アドバイスのおかげでうまくいきそうな気がしてきました。 試行錯誤して、またご報告申し上げたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1853-13 - 2010/01/12 (火) 19:23:58 - CJ 洗剤使用後に膜タンパクの免疫反応性が保持されるか、との疑問ですが、私の経験では問題ないものが多いように思えます。ただ、やはりこればっかりは試してみないとわからないと思います。

(無題) 削除/引用 No.1853-12 - 2010/01/12 (火) 19:05:55 - たんぱく 有機溶媒系を固定に使う場合には 透過は必ずしも必須ではありません。 培養細胞で-20℃、10minメタノール処理で 充分に細胞内蛋白質は染まります。

(無題) 削除/引用 No.1853-11 - 2010/01/12 (火) 17:16:53 - すけ みなさまアドバイス有難うございます。 triton使用します。 ただ、CD10は膜蛋白なので、細胞に穴をあけると聞くと果たして 綺麗に染まるだろうかと少し心配ではあります。 どなたかご存じの方もしくは経験済みの方おられますか 細胞質タンパクの染色と細胞膜タンパクの染色は FACSではサポニンを使って細部膜に穴をあける方法がありました。 違いが分かりませんがtritonのかわりにサポニン使ってみるのも手でしょうか

(無題) 削除/引用 No.1853-10 - 2010/01/11 (月) 02:02:34 - Incognito 細胞質たんぱくのαSMAを染色なさるということですので、 細胞の透過処理は必須です。透過処理の方法はいくつかありますが、 繊維芽細胞であればTritonが無難だと思います。 固定処理後に透過処理を行ってください。

(無題) 削除/引用 No.1853-9 - 2010/01/08 (金) 19:06:41 - CJ 細胞表面の電荷が抗体の非特異的吸着を招くのでタンパク質を使ってこれを防ぎます。なぜこの場合normal goat serumがよいのかについては宿題としておきましょうか。（ほかのものを使ってはいけないわけではないですよ。理論的にこれが最適なのです。） TritonやTweenを入れるのは、細胞膜を破壊して抗体の浸透性を高めるためです。培養細胞で細胞質のタンパクを染める場合には入れたほうが良いような気がします（私は培養細胞をやったことがないのでこれは理屈からです）。

(無題) 削除/引用 No.1853-8 - 2010/01/08 (金) 16:37:17 - すけ 親切なアドバイス大変ありがとうございます。 みなさんの意見を集約しまして次のようにしようかと考えています。 １．エタノール、アセトンで処理したカバーガラス上に細胞を播く ２．固定(乾燥後4%PFA固定もためしてみる) ３．1% normal goat serumでブロッキング ４．一次抗体を投与 　　　mouse抗CD10抗体＋rabbit抗SMA抗体(購入する) ５．二次抗体を投与 　　　Alexa488 goat anti-mouse＋Alexa568 goat anti-rabbit(購入する) ６．DAPI投与 ７．レーザー顕微鏡で観察 　　　波長フィルタが403, 488, 561, 636でしたのでAlexa568を購入することにしました。 抗体はhighly cross absorbedを使用し、kodamaさん、CJさんのおっしゃるように単染色標本との比較も行います。 基本的な質問で恐縮ですが、抗体の希釈液って何を使うべきなのでしょうか。当研究室のプロトコールでは細胞免染では1%FBS,1% normal goat serumと書いてあったり、ソーティングの時はPBS使ったり、westernの時はPBST,TBST使ったり、免疫組織化学染色ではスキム上精使ったりです。今回の細胞蛍光免疫染色を行うにあたりこれを使った方がいいというものがございますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1853-7 - 2010/01/07 (木) 12:13:05 - CJ kodamaさんのアドバイスは重要です。 ともあれ、 ２次抗体が"highly cross absorbed"になっていることを確認してください。 その上で２重染色は同時に行うことができます。 つまり ステップ１：１次抗体２つ ステップ２：２次抗体２つ ２次抗体がヤギ由来なら、ブロッキングは1% normal goat serumがお勧めです。（なぜでしょう？） ただし、いくら"highly cross absorbed"といってもcross reactionが絶対におきないとは保証しません。ですから、kodamaさんのおっしゃるように単染色標本を用意して、２重染色標本と分布が一致することを確認する必要があります。

(無題) 削除/引用 No.1853-6 - 2010/01/07 (木) 11:59:05 - kodama 焦りは禁物だと思います。 現時点で質問者さんには ・細胞がはがれてしまう問題 ・１次抗体の片方を別の動物種に変更する の、２点の問題が残っているはずです。 特に抗体の変更は希釈倍率からブロッキング条件まで、単独染色で検証しなおす必要があります。 それら２つを解決してから多重染色に入らないと貴重な抗体を無駄にしてしまう可能性があります。 最悪、 mouse monoclonal anti-αSMA抗体 (DAKO) mouse monoclonal anti-CD10抗体(Leica) で、多重染色を行う方法も「免疫染色のコツ」には紹介されているのですが、（ＺＥＮＯＮ標識）、ここの過去ログを参照すると多くの方があまりお勧めではないというコメントを書かれています。

(無題) 削除/引用 No.1853-5 - 2010/01/07 (木) 11:28:34 - すけ お返事ありがとうございます。 コート付きスライドを使用していたと思いますが再度確認します。 また、蛍光分子が直接付いている１次抗体があるのに、なぜ１次抗体→蛍光付き２次抗体という方法をみんなとるのだろうと疑問でしたが、感度が悪く蛍光顕微鏡に不向きだからなのですね。理解しました。 アドバイスのとおりウサギ由来の一次抗体を購入しようと思います。 その時は、 マウス１次抗体→抗マウス２次抗体→ウサギ１次抗体→抗ウサギ２次抗体 もしくは ウサギ１次抗体→抗ウサギ２次抗体→マウス１次抗体→抗マウス２次抗体 の流れでよかったでしょうか。 ともにブロッキングは1%FBSでいいでしょうか。 羊土社の「免疫染色のコツ」注文しました。免疫染色の勉強をしたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1853-4 - 2010/01/05 (火) 17:28:38 - CJ スライドグラスはコートスライドですか？コートスライドですと、kodamaさんのおっしゃるように後固定が有効です。コートしてないと普通ははがれてしまうでしょうね…。 生細胞の染色は表面抗原なら可能でしょうが、細胞内の分子では難しいでしょうね。また生細胞免疫染色はセルソート以外の用途では通常やらないので、やめたほうが無難でしょう。 さて、見たところお持ちの抗体では２重染色は不可能ではないが、かなり厄介ですね（すべてマウスＩｇＧなので）。まず、蛍光分子が直接くっつけている１次抗体はそれだけではちょっと感度が悪いのであまり免疫組織化学には使いたくないですね。 手持ちの抗体でどうにかするなら、１次抗体と２次抗体をあらかじめ混ぜておいてそれで２重染色する方法や(過去ログにあります）、ＣＤ１０とＳＭＡのどちらかで染色を完了させてから、あらためて染色を行いなおす方法などがありますが、初心者向けではありません。 抗ウサギＩｇＧ蛍光抗体をもっているんですから、ウサギ由来の良い１次抗体を購入することを検討するのが良いのでは？ また、質問者さんはどうも免疫組織化学の理屈をご理解されていないようなので、いくつか本を読んで勉強してください。

(無題) 削除/引用 No.1853-3 - 2010/01/05 (火) 16:07:20 - すけ 返答ありがとうございます。 固定に関しては、培養に使用しているポリエチレン製のシャーレ上ではあまり剥がれなく、スライドガラス上だとはがれやすい印象があるのですが、そういうものなのでしょうか。 乾燥後の固定も試してみます。 単染色は一応うまくいくことを確認しました。 羊土社の「免疫染色in situ 最新プロトコール」参考にさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.1853-2 - 2010/01/05 (火) 15:12:24 - kodama まずは単独で染める方法を確立させてみてはいかがでしょうか。 細胞がはがれてしまう場合、乾燥後 PFA or メタノール固定する方法も試してみると良いかもしれません。 （乾燥によって染まらなくなる場合もありますので検討が必要です） 二重染色のプロトコールは羊土社の「免疫染色in situ 最新プロトコール」に詳しく紹介されています。この書籍は凍結切片用のプロトコールですが、同じく羊土社の「免疫染色のコツ」と組み合わせることで対応できると思います。

細胞蛍光免疫染色 削除/引用 No.1853-1 - 2010/01/05 (火) 13:31:19 - すけ いつも参考にさせていただいています。 ヒト線維芽細胞の2重染色をしたいと考えています。 1.膜蛋白であるCD10を緑色 2.細胞質蛋白であるαSMAを赤色 に染め共焦点顕微鏡で撮影したいと思います。 2重染色をしたことのない初心者なので基本的な質問をさせていただきます。 1.それぞれの抗体の動物種、そめる順番はどのようにすべきですか? 2.固定後、洗浄の段階で細胞がはがれてしまうのですが、おすすめの固定版ガラス、固定液(4%PFA,MtOH)はありますか?　また固定せずに生細胞でも2重染色できますか？ 当研究室にある関連抗体は以下です。 PE-conjugated mouse anti-αSMA抗体 (RD) FITC-conjugated mouse anti-CD10 (BD) PE-conjugated mouse anti-CD10抗体 (BD) mouse monoclonal anti-αSMA抗体 (DAKO) mouse monoclonal anti-CD10抗体(Leica) Alexa488 goat anti-mouse Alexa488 goat anti-rabbit Alexa546 goat anti-mouse Alexa546 goat anti-rabbit Alexa594 goat anti-mouse これらを駆使して2重染色できるでしょうか

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