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(無題) 削除/引用 No.1849-9 - 2010/01/06 (水) 09:41:28 - MP 抗体１分子あたりという意味ではκとλどちらかしか持ってないです。教科書的には、マウスの場合κとλの比は20:1なので、大抵は大丈夫だと思いますが、全くシグナルが出ない場合はλなんだろうな、という感じで使っています。

(無題) 削除/引用 No.1849-8 - 2010/01/05 (火) 23:38:16 - Tak さらなるレスポンスありがとうございます。 >これはIPの時に用いたProtein A/G（多分Protein A)が正体でしょうね。 今回のIPに使用したのはDynabeadsのProteinGなので、コンタミしてくるとしても25KDaに出てくるかと思います。 一応、Trueblotでうまくいかないことも考えて、monoclonal anti-mouse IgG light chain HRPも使って行おうと考えているのですが、 MPさんが書いている >λ light chainには反応しない についてなのですが、自分の使っている一次抗体のisotypeはIgG1なのですが、これがκ light chainを持っているかどうかというのはどうすればわかるのでしょうか？ふつう、λ、κの両方のlight chainを持っているものなのでしょうか？ ご存知でしたら教えていただけたら幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1849-7 - 2010/01/05 (火) 20:08:25 - MP 今も売られているかどうかわかりませんが、Pharmingenのmonoclonal anti-mouse IgG light chain HRPではheavy chainは全く出ません。しかしλ light chainには反応しないのが難といえば難です。それから、なぜかRabbitのheavy chainに強烈にクロスします。

(無題) 削除/引用 No.1849-6 - 2010/01/05 (火) 19:55:29 - ごんべい これはIPの時に用いたProtein A/G（多分Protein A)が正体でしょうね。 この場合Trueblotを用いても回避できません。 Protein A/G agaroseを用いずに抗Ig beadsを用いると解決します。 下記サイトご参照ください。 http://baybio.co.jp/jd/detail.php?sk1=18&sk2=8816

ありがとうございます 削除/引用 No.1849-5 - 2010/01/04 (月) 21:36:09 - Tak 貴重なご意見ありがとうございます。 >還元変性したIgには反応しない二次抗体もありますので（商品名　Trueblotなど） さっそく試してみようと思います。 ただ、過去のスレッドを読み直すと強く焼くと少し出てくると書いてあったので、light chain specificのanti-mouse secondary antibodyでも試してみようと思います。 これだと原理的にはheavy chainのバンドが全く出ないのかと思うのですが、実際のところはどうなのでしょうか。ご存知の方がおられたら教えてください。 >Workしていることを確認したcell lineのライセートをIP後のサンプルと一緒に流したときに、IgGらしいバンドと目的のバンドはずれて見えるのでしょうか？ なんとなくずれているような気がするのですが、ほぼ同じ場所でかなり流して分離を試みたのですが、判然としませんでした。

(無題) 削除/引用 No.1849-4 - 2010/01/04 (月) 21:36:02 - ケラレ 50Kのバンドであちこち出てくるというので思い出すのは、ケラチンです。電気泳動の試薬、特にグリセリンに含まれていたことがありました。人の皮膚由来でしょう。未精製のpolyはケラチン抗体も含まれてる場合が結構あるようです。これがblotと反応させる抗体がmonoなら出ないはずで、区別がつきます。分子量でもよく見れば区別がつく場合が多いですが。

Trueblotが買えればそちらの方がいいですが 削除/引用 No.1849-3 - 2010/01/04 (月) 20:54:46 - ~ Workしていることを確認したcell lineのライセートをIP後のサンプルと一緒に流したときに、 IgGらしいバンドと目的のバンドはずれて見えるのでしょうか？ 若干でもずれるのであれば、ゲルの濃度を調製して、 ゲルの下のほうまで流せば、区別できるようになるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1849-2 - 2010/01/04 (月) 17:28:05 - AP anti-Ig抗体は異種のIgに対しても多かれ少なかれ「交差性があるのがあたりまえ」なので、やはりmouse IgGのheavy chainに二次抗体が交差反応したのが見えているのだと思います。 どのくらい交差性があるかは製品によります。目的種のIgへの反応性だけが保証されていて交差性には全く配慮していないものもあれば、異種のIgに対して吸収処理を行って、交差性を低く抑える処理をしていたり（とは言っても程度の問題で全く交差反応が起こらないことを保証するものではない）するものもあります。非常に種特異性の高いエピトープにたいするモノクローナル抗体なら交差反応の心配はあまりないかもしれません。 お使いの二次抗体はどの程度のものでしょうか。 試しに、mouse Igを直接immunoblotしてRabbit二次抗体で検出してみたら、たぶん同じバンドが出るのではないでしょうか。通常ならバックグラウンドとして無視できる程度の強度の交差反応でも、目的とするバンドの強度が非常に弱ければ、そればっかりが目につくということはあると思います。 それと、還元変性したIgには反応しない二次抗体もありますので（商品名　Trueblotなど）、そういうのを使うと、紛らわしさが減るかもしれません。

IP・WBでの50KDaのバンドについて 削除/引用 No.1849-1 - 2010/01/04 (月) 15:16:09 - Tak ご相談させてください。 現在肝組織における分子量約50KDaの既存の蛋白のWBを行っているのですが、なかなかうまくいかず、調べていくと肝臓では非常に発現量が少ない蛋白であるようなので、IPで濃縮してWBを行おうとしています。 cell lineなどでworkすることが確認できている抗体を用いて、まずmouseのモノクローナル抗体でIPしてrabbitのポリクローナル抗体でWBを行ってみたところ50KDa付近にバンドは出るのですが、negative controlとしてmouse IgGでIPしたsampleでも似たような部位にバンドが検出されました。mouseの抗体でIPしてmouseの抗体でWBしたのならこの場所にIgGのheavy chainのバンドが出てもよいかと思うのですが、rabbitの抗体でWBを行ったにもかかわらず出現するので、これがいったい何を見ているのかわからず困っています。 情報として足りないところもあるかと思いますが、なにかアドバイスをいただけますと幸いです。よろしくお願いします。

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