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Co-IPの界面活性剤 削除/引用 No.1845-12 - 2010/01/12 (火) 13:48:20 - IP Co-IPするときのデタージェントはTritonX100, NP-40, Tween20, ジギトニン、デオキシコール酸など、いろいろ見かけますが、どういう風に選んでますか？ 膜タンパク質とアダプターのco-IPをしていおり、膜タンパク質が可溶化されるが相互作用はこわれないのを探しています。可溶化の強さに順番が有るのでしょうか？それともケースバイケースでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1845-11 - 2010/01/08 (金) 04:49:41 - おお >[Re:10] やすさんは書きました : > 遅くなりましたがたくさんのアドバイスありがとうございます。 > > ご指摘の通り自身でIPをするのは初めてなので、今の研究室で過去に使っていた方法で試しております。IPする抗原の発現が少ないものと考えて、蛋白量を増量して試す予定です。 ウエスタンででてIPすると出ないわけですよね、、、、、 本質を見失っていないか心配です。

ありがとうございます 削除/引用 No.1845-10 - 2010/01/07 (木) 22:56:45 - やす 遅くなりましたがたくさんのアドバイスありがとうございます。 ご指摘の通り自身でIPをするのは初めてなので、今の研究室で過去に使っていた方法で試しております。IPする抗原の発現が少ないものと考えて、蛋白量を増量して試す予定です。 うまく行かなければ、抗体、ビーズ、ライセートの条件を再検討してみます。 また分からないことがあれば相談させていただきます。よろしくお願いします。

磁気ビーズ 削除/引用 No.1845-9 - 2010/01/06 (水) 16:08:10 - のり 　担体のアガロースビーズを磁気ビーズに代えてみてはいかがでしょうか。 蛋白の発現量が少ないのでしたら、高感度な磁気ビーズもあります。 ご参考まで。 　（http://magnabeat.com/index.html）

(無題) 削除/引用 No.1845-8 - 2010/01/03 (日) 10:21:42 - おお みなさんのコメントに賛成しますね。 一般的なことはいくらでもかけますが、個々のケースで解決策に なるとは限りません、 たとえばデタージェントなど厳しくした方がいいという理屈を 書きましたが、抗体とタンパクの相互作用がデタージェントで 阻害されている可能性があるなら、デターデントをもっとマイルド にしないといけないかもしれません。 RIPAとか使っているなら、TRITONのみにしてみるとか、、、、

(無題) 削除/引用 No.1845-7 - 2010/01/03 (日) 00:27:01 - c IPの成否はいろんな要素がからむので一概に言うのは難しいですが、経験的には抗体次第というのが一番大きいと思います。IP出来る抗体は,　（いい加減な条件も含めて）かなり多様な条件下でやっても一応抗原を捕まえてくるし、そうでないものは、どんなに細かくに条件振ってもうまくいきません。使えるかダメかでなんか中間がない感じです。IP出来ると書いてあってもできないものありました。書いてなくても出来たものありました。ただIPはダメでもwesternやIHCは非常にうまくいくものは多いです。だから、抗体の優劣でなく用途別の適不適と理解して下さい。できれば全長蛋白質を抗原にして作ったポリクロや抗血清を使う。モノクロや短い部分ペプチドで作ったポリクロはできれば避ける。関連論文で実際にIPがうまくいってるデータを探し、そのメーカーの抗体を買う。また学会などでの情報収集も有益です。あとロットが変わるととたんにうまくいかなくなる事があるので、それも注意して下さい。

(無題) 削除/引用 No.1845-6 - 2010/01/02 (土) 22:11:06 - リバ >その抗体は普通のウエスタンでは使えるので、抗体自体が悪いのではないと考えています。 ウエスタンで使えても、IPに使えないのはたくさんあります。当たり前ですが、当然、仕様書にIPに使えると書いてないとダメですよ。

私なら 削除/引用 No.1845-5 - 2010/01/02 (土) 20:27:55 - モモ ＩＰしたい蛋白の具体名をあげてＩＰの効率の良い抗体の情報をここで聞きますねぇ。これが近道だと思います。 それができないなら、まずは今持っている２種類の抗体で同じライセートからＩＰしてみて、どちらが効率よくＩＰできるのかをチェックしますね。 （もちろんできれば、手に入る抗体は４、５種類購入して、一度に確かめたほうが効率はいいですが。） それと、ここで質問している内容からして、やすさんは恐らくＩＰ経験はあまりないのだろうと推察しますが、いきなりエンドの蛋白のＣｏ−ＩＰは難しいんじゃないでしょうか。タグの抗体ならＩＰもＷＢも定番がありますし、蛋白を過剰発現させたらＩＰもＷＢも簡単ですよね。 ネガコンはきちんとおいていますか？エンド同士のＣｏ−ＩＰだと本当の意味でのネガコンはなかなか難しいんですが、それでも最低限のネガコンもないと、何を見ているかわからないですよ。

(無題) 削除/引用 No.1845-4 - 2010/01/02 (土) 14:42:10 - おお 取り急ぎ >[Re:3] やすさんは書きました : > 初歩的な質問ですが、ライセートに含まれる目的蛋白によって異なるのでしょうが、一般的に何ugくらいの蛋白量を使用するものでしょうか。現在150ugくらいで行っていますが、量が少ない可能性はありますか。おそらくIPで引っ張ってくる蛋白はそう多くないものと考えております。 150ugはそんなに悪くない量ですが、まあ1mg位までは上げてもいいかもしれない ですね。だいたいその辺までを基準にしてます。 >またウエスタンでよい結果が得られてるのに、その抗体でIPしてウエスタンするとバンドがでないことはよくありますか。IPをやっている他の研究者も同じ現象で悩んでいます。 頻度としてよくあるかどうかはちょっと分からないですが、 あります。理由は前のコメントをもう一度見て考えてください。 リコンビナントからつくったポリクロならエピトープ部位があちらこちらに 散在するのでIPしやすい事はあり得ると思います。ですから前回のような 質問をさしあげました。 立体障害的な要因が大きいなら、ライシスバッファーのデタージェント、 塩濃度など上げてみて、邪魔なタンパクのコンプレックスの形成を パーシャルに壊すとかも一つの方法だと思いますけど、確証がない とできるとはいえませんけど、、、 考えている相手がエピトープ部位をカバーしていたらまずIPでその解析は 無理です。

(無題) 削除/引用 No.1845-3 - 2010/01/02 (土) 13:43:00 - やす おおさま、ありがとうございます。 用いている抗体はポリクロです。おっしゃるとおり最適な抗体を見つけるのが、一番早道なのでしょうか。論文を参考にして２種類購入して試したのでコストの問題もあります。 IPとウエスタンの抗体をスイッチするのも検討しましたが、IPで引っ張る蛋白での相互作用をみるのが目的のため行っていません。 初歩的な質問ですが、ライセートに含まれる目的蛋白によって異なるのでしょうが、一般的に何ugくらいの蛋白量を使用するものでしょうか。現在150ugくらいで行っていますが、量が少ない可能性はありますか。おそらくIPで引っ張ってくる蛋白はそう多くないものと考えております。またウエスタンでよい結果が得られてるのに、その抗体でIPしてウエスタンするとバンドがでないことはよくありますか。IPをやっている他の研究者も同じ現象で悩んでいます。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1845-2 - 2010/01/02 (土) 04:55:24 - おお その抗体は免疫沈降には向いていないかもしれません。 ポリクロでしょうか、ポリクロの場合へプチド抗体でしょうか。 抗体が変性したタンパクに反応するが、そうでなければ反応しない可能せい。 エピトープ部位がタンパク相互作用や、タンパクの構造上露出してない可能性。 などが可能性としてあります。 お示しの例では効率は悪いが回収できている可能性はありますね。 IPで使える抗体を探すのが一番スッキリしますけど、、、 たとえばIPするタンパクと、IPごウエスタンするパートナーを スイッチしてみてはどうでしょうか?

免疫沈降について 削除/引用 No.1845-1 - 2010/01/02 (土) 01:47:41 - やす いつも参考にしております。 免疫沈降についてなのです。 免疫沈降した蛋白のウエスタンを、その蛋白を引っ張るのに使用した抗体で行ったのですが、そのバンドが得られません。抗体希釈率などふったり、また抗体も別のに変更しましたがだめでした。 その抗体は普通のウエスタンでは使えるので、抗体自体が悪いのではないと考えています。また引っ張ってきた蛋白と結合していると思われた蛋白の抗体（普通のウエスタンではバンドがでなかった）ではバンドが得られています。 免疫沈降に使ったのはアガロースビーズで、サンプルをプレクリアした後、一次抗体はO/N、ビーズ1hrの後washx3で、サンプルバッファ追加、boil5minです。 何か良いアドバイスをいただければと思います。よろしくお願いします。

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