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(無題) 削除/引用 No.1844-10 - 2010/01/05 (火) 10:19:34 - やま > そうすると、ゼロ点調整は、RNAを溶かした物とおなじ液体（RNAse Free水）をRNAサンプルと同じようにバッファーで50〜100倍希釈したもので行うのですか？ そうです。ブランク＝ゼロ点調整です。RNAが溶けている以外はサンプルと同じ溶液を作ってそれをブランクにします。 > TRIzolの組成を見ると、塩とフェノールが入っているので、細胞を破砕しながら65℃くらいで温めるという操作がホットフェノール法と同じなのではないかと思ったので。酵母だと、はじめにフェノール処理してからTRIzolを加えるんですね。 普通のホットフェノール法はTRIzolではなくフェノールを使います。 TRIzolを使った方法は見た事がないです。（あったらすみません） > ガラスビーズとTRIzolとホットフェノール法を併用したプロトコールが参考書に載っていませんでした。酵母では、よくホットフェノール法が本に載っていますが、枯草菌でのプロトコールがよくわかりません。 そもそも、ホットフェノールのフェノールをTRIzolにした理由はなんでしょうか？ 枯草菌でもとりあえず同じようにやってみれば良いのでは？と思うのですが。 参考書にはTRIzolでの方法が載っているのでしょうか？ ホットフェノール法ではガラスビーズは使わないと思います。 （ホットでない）フェノールとガラスビーズの組み合わせなら見た事があります。 これはAmbionのキットなのですが（酵母用）プロトコルも見られるので参考にしてはどうでしょうか？ フェノールとビーズ破砕の組み合わせです。 かなり綺麗に取れるようです。 http://www.ambion.com/jp/catalog/ProdGrp.html?fkApp=1&fkSubApp=197&fkProdGrp=294 もし、近くに枯草菌をやっていて詳しい方がいないのでしたら、 買うつもりがなくても業者に枯草菌の時はどのキットが良いか？ とか聞いてみてその製品のプロトコルを参考にしてみるのが良いのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1844-9 - 2010/01/04 (月) 00:08:37 - ふーむ君 アドバイスありがとうございます。 そうすると、ゼロ点調整は、RNAを溶かした物とおなじ液体（RNAse Free水）をRNAサンプルと同じようにバッファーで50〜100倍希釈したもので行うのですか？ TRIzolの組成を見ると、塩とフェノールが入っているので、細胞を破砕しながら65℃くらいで温めるという操作がホットフェノール法と同じなのではないかと思ったので。酵母だと、はじめにフェノール処理してからTRIzolを加えるんですね。 ガラスビーズとTRIzolとホットフェノール法を併用したプロトコールが参考書に載っていませんでした。酵母では、よくホットフェノール法が本に載っていますが、枯草菌でのプロトコールがよくわかりません。 もう一度、論文を探してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1844-8 - 2010/01/02 (土) 21:01:23 - やま RNAサンプルをバッファーで50〜100倍に希釈して測定します。 ブランクをRNAを溶かした物とおなじ液体（RNAse Free水）をRNAサンプルと同じように希釈したものを使います。 その値からRNAの濃度を計算します。 酵母のRNA取りならやった事があるのですがそのときはTRIzolではなく フェノールを使い、エタ沈（イソプロ沈）した後にDNase処理をした後に TRIzol（＋クロロフォルム）で精製してエタ沈していました。 TRIzolを最初に使う方法は聞いた事がないです。 枯草菌では普通の方法なのでしょうか？ 方法論の論文か実験書みたいなのはないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1844-7 - 2010/01/02 (土) 11:25:09 - ふーむ君 アドバイスありがとうございます。 バッファーでOD測定した値から、RNA濃度を算出するんですよね？ 後、TRIZOLを使ったホットフェノール法をご存じの方がいればアドバイスお願いします。TRIZOL試薬は温めてもよい試薬なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1844-6 - 2010/01/01 (金) 22:37:57 - やま 遠心してピペットでできるだけ液を取り除くぐらいで良いと思いますよ。 乾燥させると本当に溶けなくなります。 溶けてるように見えてもボルテックスなどで攪拌してみると 透明な膜のような物が見えます。 ODはTris-HClのpH8ぐらいか、TEで測るのが良いですよ。

(無題) 削除/引用 No.1844-5 - 2010/01/01 (金) 13:33:43 - ふーむ君 乾燥は、室温でしたほうがいいんですかね？

(無題) 削除/引用 No.1844-4 - 2010/01/01 (金) 08:01:43 - ザンギ 枯草菌については扱ったことがないので、このプロトコルが枯草菌に適して いるのか否か判断できませんが、一般的なことに関して >・上清を除去し、5min真空乾燥し、RNAse Free水を加え、ボルテックス >で1min混ぜ、55℃で10minインキュベートして、RNAを溶解させる。 普通は真空乾燥はしません。 理由は溶けなくなるから。 溶けにくい場合には薄いNaOH溶液を使うこともあるらしいですが、僕は 使ったことがありません。 >・サンプルをRNAse Free水で希釈して、OD260/OD280の比率を求める。 水ではなくて、何らかの緩衝液を使います。 核酸のUV吸収はpHに依存するから。 以上の点についてはMolecular Cloningレベルの実験書をご覧になれば 書いてあることと思います。

すいませんでした。 削除/引用 No.1844-3 - 2009/12/31 (木) 22:23:16 - ふーむ君 みなさん、すいませんでした。okwaveの方は削除させていただきました。 常識がなくて、すいません。

枯草菌のＲＮＡ抽出について 削除/引用 No.1844-1 - 2009/12/31 (木) 17:44:03 - ふーむ君 枯草菌のTotal RNA抽出を試みたのですが、OD260/OD280の比率が1.4と大変低い値となって困っています。抽出方法は、TRIzol試薬を用いています。以下にプロトコールを示します。このプロトコールに何かおかしい点があればアドバイスお願いします。 ・エッペンに4.5ml分の培養液を入れ、遠心（8000rpm、4℃、5min)して培地を取り除く。 ・そこにガラスビーズとTRIzol1mlを入れ、手＋ボルテックスで破砕後5分室温で放置。 ・0.2mlのクロロホルムを加え、手で強く振って混合し、5分室温で放置後、遠心（12000rpm、4℃、15min)して上層（0.4ml)を集める。 ・集めた上層に等量のイソプロパノールを加え混合し、室温で10分室温で放置後、遠心（12000rpm、4℃、10min)。 ・上清を除去し、冷却75％エタノール1mlを加え、ボルテックスで混合後、遠心（7500rpm、4℃、5min)。 ・上清を除去し、5min真空乾燥し、RNAse Free水を加え、ボルテックスで1min混ぜ、55℃で10minインキュベートして、RNAを溶解させる。 ・サンプルをRNAse Free水で希釈して、OD260/OD280の比率を求める。 自分的には、最後のRNAの溶解を完全にできなかったことやサンプルを希釈する際にRNAse Free水でよいのかなどを思っています。 また、ホットフェノール法を併用すると収率が上がると聞いたことがあるのですが、これはTRIzol試薬を65℃に温めて、破砕するということなのでしょうか？いろいろ質問してしまってすいません。

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