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(無題) 削除/引用 No.1838-4 - 2010/01/02 (土) 02:15:34 - ポスドク T 自分はStreptomycin以外のChloramphenicol,Tetracycline,Kanamycinはプロトコル通りで上手くいきました。 ただし、プロトコルの濃度はSigmaのものを基準にしています。 他社から購入した抗生剤を使用する場合は、 active concentrationを合わせる必要があります。 その点は気をつけてください。

(無題) 削除/引用 No.1838-3 - 2009/12/31 (木) 14:58:53 - genetics ありがとうございます。 スタートのLB cultureを10倍量に増やしても上手く行かず困っていました。 ネガコンとして、組み替えDNA fragmentなしもやってみましたが、 かなりのコロニーが生えてしまっていました。 BACの内部でdeletionが起きてしまっているのかと考え、アラビノース添加後の37℃の反応時間を10分にしたり、エレクトロポレーション後の培養を30℃にしたり試行錯誤しましたが、 ストレプトマイシンの濃度を上げるのは思いつきませんでした。さっそくやってみます。 ポスドクT様はストレプトマイシン以外の条件はプロトコル通りでしたか？ 差し支えなければ教えて頂けないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1838-2 - 2009/12/31 (木) 06:57:04 - ポスドク T この系におけるストレプトマイシン選択は、 かなり切れが悪いです。 プロトコルのストレプトマイシン濃度（50μg/ml） ではネガコンでかなりのバックが出るため、 当たりをピックアップするのにはかなり苦労を要します。 自分はストレプトマイシン濃度150μg/mlで選択をかけて上手くいくようになりました。 それでも少しはバックが出るので、ネガコンは常に置いたほうが良いと思います。 プロトコルに掲載されている抗生剤濃度が至適濃度とは限らないので、 上手くいかない時は自分で最適条件を探しつつ系を確立するのが良いですよ。

BAC相同組み替え 削除/引用 No.1838-1 - 2009/12/29 (火) 21:35:46 - genetics いつも勉強させて頂いてます。 現在、gene bridge社のRed/ET Recombination System Counter-Selection BAC MODIFICATION Kitを用いて、BACの相同組み替えを行っております。 １回目の相同組み替え(rspL-neo挿入)はうまくいくのですが、 ２回目の相同組み替え(目的のDNA fragmentとの入れ替え)が成功しません。ストレプトマイシン耐性のコロニーが無数に生えるのですが、どれもコロニーPCRなどでは外れです。 どなたかご経験をお持ちの方いらっしゃったら、アドバイス頂けないでしょうか？

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