全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1836-9 - 2010/01/02 (土) 12:58:34 - 中年 あいまいな書き方をしてしまってすみません。そのくらいのクローン数をスクリーニングするのであれば、コロニーハイブリダイゼーションをしないで、PCRとsib-selectionだけでクローンにまで追い込めるのではないかと言いたかったんです。

(無題) 削除/引用 No.1836-8 - 2009/12/30 (水) 09:04:53 - DSC 皆さま、ありがとうございます。 今回は既に10cmディッシュ×10枚での1st screeningで検出した候補部分24個をそれぞれ寒天培地にストリークしてしまいました。 出てきたsingle colonyを10個くらいずつ1枚の寒天培地に集めて植えたアレイを作り、それで2ndのコロハイを行おうかなと思っています（ひと手間かかるけど、楽に確実に単離したいので）。 > ザンギさま > 中年さま そうですね。狙っているクローンの増殖が悪いかもしれないので、 安易に液体培養しないように気をつけます。 > その程度のcomplexityのライブラリからのクローニングなら、 > PCRを使ってsib-selectionするというのはいかがですか？ それは「コロハイでの1st screeningの後をPCRでのsib-selectionで」ということでしょうか？ リフトの方法についても、今後の参考にしたいのでご意見を頂けると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1836-7 - 2009/12/29 (火) 22:38:17 - 中年 その程度のcomplexityのライブラリからのクローニングなら、PCRを使ってsib-selectionするというのはいかがですか？

(無題) 削除/引用 No.1836-6 - 2009/12/29 (火) 12:58:44 - おお あ、実際のコロニーの数で10^4とライブラリーの独立クローンのかずで10^4では 話が違ってきますよ。独立クローン10^4だと、きっちり10^4こクローンをまくわけでないので2ndは1次と同じようにまいた方がいいとおもいます。 このとき、ストリークで分離可能な程度のクローン数であれば3ndはそれでもいいかもしれません。 ストリークすると言いい点は液体では増えにくいクローンでも寒天上 のほうが安定して増える、またクローンが分離していれば増えにくい ものは小さなクローンができるけど、液体では増えにくいのは 数としてマイナーになっていくので分離に不利だからです。 スケールを再考して実験を組み立ててみてください。

(無題) 削除/引用 No.1836-5 - 2009/12/29 (火) 11:23:45 - ザンギ >モノグサせずにストリーク→2ndですかねー。 あたりクローンの増殖が悪いかもしれなくて、混ざってる状態から脱落して いく危険を考えたら、3rdくらいまでやって完全にセグリゲートしたいですね。 ３ｒｄまで持っていってコロニーがレスキューできないことがありました が、ポジティブシグナルのあるあたりを液体培地でリンスして、継代したら 生えてきた経験があります。

(無題) 削除/引用 No.1836-4 - 2009/12/29 (火) 11:11:04 - DSC > おおさま ありがとうございます。 そうですね、最初を大きいディッシュに変えて、 モノグサせずにストリーク→2ndですかねー。 その程度の密度であれば1stでisolateできることもありそうですし。 ちなみに、cDNAライブラリーです。 10^4を10枚で10^5クローンから始めています。 バリアントが多い転写産物なので、拾えるだけ（多くて50クローンくらい） 拾いたいと考えながらやっています。

(無題) 削除/引用 No.1836-2 - 2009/12/29 (火) 09:58:49 - おお ゲノムのライブラリーとかだと15cmのディシュ50枚くらいで、場合によっては 数個の当たりで、3次位までスクリーニングすると思いますけどね。 10^4このクローンなら狙ったところをピックアップしてストリークして もう一度ハイぶりすれば十分じゃないかなぁ 15cmのディッシュで1cm2で100個ぐらいのコロニーという計算ですからね。 25x25の四角いディッシュ使えば10^4だと1cm2で10-20個かな。 これだとだいぶ楽になりそうな気がしますけど。 何らかのほうほうで2ndまでやった方がいいですね。

コロハイでのisolation 削除/引用 No.1836-1 - 2009/12/29 (火) 09:15:26 - DSC プラスミドライブラリーからクローンを単離しようとしています。 1st screeningではディッシュ（φ90mm）あたり10^4クローンくらいを播き、 コロニーハイブリダイゼーションでシグナルの出たところを拾いますが、 当然isolationはできません（かなり「確からしいところ」を狙って拾いますが）。 皆さまはisolationのための絞り込みはどのようにされていますか？ 1. 拾ったコロニーを改めてディッシュに播き、再度コロハイするのが当たり前でしょうか？ この場合、2nd screeningで確実にisolationできるように希釈するのが難しい。 希釈倍率を振って何枚も播くのも、ディッシュその他がもったいないし。 特に多数のクローンを拾いたい場合は労力的にも厳しいです。 ストリークで単一コロニーを作らせてコロハイとか？ 2. 以降コロハイは行わず、薄く播き直して単一コロニーを複数拾い、 プラスミド抽出あるいはコロニーPCRでアタリを同定する。 こちらは最終的にチェックするコロニー数が多くなるのが難点。 大きくは「1st screening以降に再度コロハイをやるかやらないか」ですが、 皆さまどのようにされているのでしょうか？ ついでにもう一つ質問させてください。 私は、ライブラリーを寒天培地に広げてコロニーを作らせ、 そこに直接ナイロンフィルターを貼付けてコロニーリフトしていますが、 コロニーのほぼ全体がフィルター側に付いてしまい、 寒天培地を再度インキュベートしてもコロニーが元のように育ってくれないことがあります。 そのようにならないような方法があれば、ご教授ください。 プロトコール本などにあるように、あらかじめフィルター上にコロニー形成させ、 その後新しい寒天培地上にレプリカコロニーを作らせるべきでしょうか？

全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---